高通量测序后的下游实验验证方法之DNA甲基化篇
2023-02-28 来源:本站 点击次数:1198
上一篇，我们分享了DNA甲基化研究的测序数据挖掘思路，进而鉴定出研究的目的基因或目标区域的DNA甲基化。
做完测序后，如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证，则需要进行下游实验设计。DNA甲基化研究的后期验证包括简单验证、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证等。
一、简单验证
二、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）
ü DNA甲基化抑制剂
阿扎胞苷（5-Aza）能够通过与DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共价键抑制其酶活性，使细胞的DNA甲基化水平降低。
ü DNA斑点杂交（定性）
ü 比色法（定量）
ü 质谱法（定量）
三、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证
ü CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化实验：在细胞中人为表达目的基因，或通过CRISPR-Cas9系统靶向编辑DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修饰。
ü 功能标志物测定
ü ... ...
CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化技术
目标区域DNA甲基化的验证手段——Target-BS（靶基因重亚硫酸盐测序） 
做完测序后，如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证，则需要进行下游实验设计。DNA甲基化研究的后期验证包括简单验证、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证等。
一、简单验证
- 目标基因DNA甲基化的验证：Target-BS
- 检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
- 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
二、全基因组甲基化干扰实验（非靶向）
- DNA甲基化干扰：
ü DNA甲基化抑制剂
阿扎胞苷（5-Aza）能够通过与DNA甲基化酶DNMT蛋白家族形成共价键抑制其酶活性，使细胞的DNA甲基化水平降低。
- 检测整体DNA甲基化变化：
ü DNA斑点杂交（定性）
ü 比色法（定量）
ü 质谱法（定量）
- 检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS
- 检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
- 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
三、靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验验证
- 目的基因DNA甲基化的干扰：
ü CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化实验：在细胞中人为表达目的基因，或通过CRISPR-Cas9系统靶向编辑DNA甲基化在目的基因上加上/擦除甲基化修饰。
- 检测目标基因的DNA甲基化变化：Target-BS
- 检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
- 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
- 检测细胞功能受到的影响:
ü 功能标志物测定
ü ... ...
CRISPR-Cas9靶向编辑DNA甲基化技术
目标区域DNA甲基化的验证手段——Target-BS（靶基因重亚硫酸盐测序）
- 靶向特定区域进行超高深度甲基化测序。
- 超高深度：可达几百到几千乘。
- 单个区域长度<300bp
- 需要设计BS引物，进行预扩增实验。
- WGBS vs. TBS相当于RNA-seq vs. RT-qPCR
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