哺乳动物胚胎从囊胚形成走向原肠运动，需要经历从着床前（E3.5）到着床后（E5.5）的围着床期转变（pre- to post-implantation transition，PPT）。这一过程伴随多能性退出、胚胎与胚外谱系建立以及全基因组抑制性表观遗传程序形成，是早期胚胎发育和细胞谱系命运决定的关键窗口期。先前的研究揭示了胚胎的DNA甲基化组和转录组等表观基因组动态，但调控细胞谱系命运的这两个分子层面之间如何协同作用尚不明确。

近日，清华大学生命科学学院、清华-北大生命联合中心周帆研究员团队利用单细胞全基因组亚硫酸盐测序（scWGBS）与单细胞转录组测序，通过scTrio-seq2技术在同一细胞内同步检测DNA甲基化和RNA表达，并结合人、猴公开数据以及DNA甲基转移酶干扰细胞模型，系统解析了E3.5至E5.5小鼠胚胎PPT过程中的分子动态变化。相关研究成果以“Dissecting pre- to post-implantation transition of DNA methylome-transcriptome dynamics in early mammalian development”为题发表于《Cell Reports》期刊。
 

标题：Dissecting pre- to post-implantation transition of DNA methylome-transcriptome dynamics in early mammalian development（早期哺乳动物发育中着床前后转变的DNA甲基化组和转录组动态解析）
发表时间：2025-06-24
发表期刊：Cell Reports
影响因子：IF7.7/Q1
技术平台：scWGBS、scRNA-seq
作者单位：清华大学生命科学学院、清华-北大生命联合中心
DOI:10.1016/j.celrep.2025.115790

本研究通过对围着床期胚胎进行单细胞多组学分析，系统揭示了DNA甲基化组与转录组在这一关键转变期的动态变化，揭示了外胚层(EPI)、内脏内胚层(VE)、胚外外胚层(ExE)等不同细胞谱系在建立特异性DNA甲基化（DNAme）谱时，表现出谱系特异性重编程模式。此外，研究还发现亲本等位基因在转座元件上的DNA甲基化差异动态变化，早期谱系特异性未甲基化启动子基因维持这一状态，并在后期表达，提示这些基因可能参与谱系命运决定。研究团队通过在单个发育细胞中同时检测甲基化和转录组水平，鉴定出一组在EPI发育过程中DNAme与RNA表达（RNAex）呈正相关的基因启动子。功能验证提示，这些启动子上的DNAme参与了非经典DNAme-RNAex动态变化，其作用可能涉及复杂的转录因子介导或表观遗传调控。本研究为理解围着床期胚胎发生的分子调控提供了线索。

研究亮点

• 在围着床期转变过程中，存在物种保守的谱系特异性DNA甲基化重编程
• VE亚型显示出分离的甲基化动态特征
• 亲本转座元件的DNA甲基化差异揭示异步擦除过程
• 鉴定出的启动子表现出非经典的DNA甲基化-转录耦合

图形摘要

• E3.5、E4.5和E5.5小鼠围着床期胚胎，覆盖主要阶段和谱系。
• 合子期、2细胞期、4细胞期、8细胞期和桑椹胚阶段单细胞，追踪亲本DNA甲基化差异擦除过程。

（2）scTrio-seq2单细胞双组学测序分析

• scWGBS：细胞核部分进行单细胞DNA甲基化测序分析，绘制单碱基分辨率DNA甲基化图谱。
• 单细胞转录组：上清部分进行单细胞转录组测序分析，获得基因表达数据。

（3）跨物种数据整合

• 整合已发表的小鼠、猴和人类早期胚胎DNA甲基化及转录组数据，比较三个物种在着床前后DNA再甲基化趋势和谱系特异性模式，判断物种保守性。
  （4）细胞模型和表观基因组扰动验证
• 利用Dnmt3a过表达和Dnmt3a/b双敲除的mESC细胞系模型以及已发表的Dnmt1/3a/3b三敲除胚胎数据，对鉴定出的正相关基因进行功能验证。

图1：PPT过程中的谱系特异性DNA再甲基化建立

1. 检测着床期胚胎（从E3.5到E5.5）转录组和DNA甲基化组示意图。
2. PCA主成分分析对转录组数据降维。
3. PPT过程中谱系特异性标志物表达模式。
4. 根据发育阶段(B)和谱系标志物表达(C)对所有单细胞进行进一步聚类和鉴定。每个谱系约8个单细胞DNA甲基化测序。
5. 通过转录组(D)鉴定细胞谱系。
6. 每个谱系的整体DNA甲基化水平。
7. DNA甲基化组数据比对发育阶段t-SNE图。
8. 所有单细胞根据DNA甲基化进行聚类。
9. t-SNE图显示人类PPT过程中的主要谱系DNA甲基化模式。

J-K. 小鼠(J)和人类(K)胚胎在PPT过程中的差异甲基化区域热图。
L-N. 小鼠、猴和人类早期胚胎发育过程中的整体DNA甲基化水平。

图2：VE亚型的特异性DNA甲基化模式

1. E5.5小鼠胚胎中VE亚型的解剖位置示意图。

B-C. 基于谱系标志物(C)表达鉴定出VE 的ExVE、EmVE和DVE(B)三种亚型。

D. 三种VE亚型的整体DNA甲基化水平。

E. 基于300bp窗口的DNA甲基化矩阵的细胞t-SNE图，并按谱系身份着色。

F. VE及三种亚型在基因体及其15kb侧翼区域中的DNA甲基化水平。

G. VE及三种亚型中DNA甲基化谷数量的柱状图。

H. VE及三种亚型在全染色体（1号染色体）范围内的DNA甲基化水平（1Mb窗口）。

1. 基于遗传元件DNA甲基化矩阵的细胞t-SNE图，并按谱系身份着色。

J. 热图显示ExVE、EmVE和DVE之间的差异甲基化元件。

K. 比较VE及三种亚型在Lefty1启动子周围的DNA甲基化水平。

图3：亲本差异DNA甲基化的异步擦除

1. PPT过程中母本（深色）和父本（浅色）DNA甲基化在全基因组中的动态变化。
2. PPT过程中的亲本全基因组DNA甲基化动态箱线图。
3. PPT过程中基因内区和基因间区之间的两种差异亲本DNA甲基化动态模式。
4. 全基因组、基因内区和基因间区中的亲本DNA甲基化动态（上）和亲本差异（下）折线图。

E-G. LTR(E)、LINE(F)和SINE(G)及其亚型中的亲本DNA甲基化动态和亲本差异。

H. E4.5期雄性和雌性细胞分布t-SNE图。

1. E4.5期不同性别谱系下的全基因组亲本DNA甲基化动态箱线图。

J. 小鼠品系从母本C57与父本DBA交配，到母本DBA与父本C57交配，随后收集并对从合子到E5.5小鼠胚胎进行测序。

K. 全基因组、基因内区和基因间区中的亲本DNA甲基化动态和亲本差异。

图4：PPT过程中谱系特异性低甲基化基因的鉴定

1. 重叠分析鉴定出437个在PPT过程中于外胚层中特异性低甲基化的启动子。
2. 外胚层特异性低甲基化基因与VE和胚外外胚层在E3.5-5.5阶段甲基化转变的热图比较。
3. 鉴定出的437个在外胚层中低甲基化但在其他两个谱系中高甲基化的基因启动子进行GO富集分析。

D-E. 先前鉴定的E6.5外胚层根据T基因表达进一步亚聚类为E6.5PS（原条）和E6.5NP（非原条）。

F. 基于E3.5-E6.5转录组数据聚类的细胞谱系主成分分析。

G. E3.5-E6.5所有谱系间差异表达基因的热图。

H. 启动子在外胚层中特异性低甲基化且在E6.5PS中特异性激活的基因热图。

1. E3.5至E6.5期间外胚层、内胚层和胚外外胚层中T位点的DNA甲基化基因组浏览器快照。

J. 柱状图显示H3K27me3在非原条细胞的T基因启动子处相对富集程度较高。

K. RNA-seq揭示在非原条细胞中，经EPZ（EPZ005687，一种PRC2复合物的特异性抑制剂）处理后，T基因显著上调表达。

图5：鉴定DNA甲基化与转录组呈正相关基因

1. 鉴定DNA甲基化与转录组呈正相关基因示意图。
2. DNA甲基化水平与发育阶段（E3-E5，x轴）及转录组与发育时间（E3-E5，y轴）斯皮尔曼相关系数。
3. 三种负相关和一种正相关DNA甲基化-转录组模式中四个代表性模式的DNA甲基化和转录组分析。

D-E. P4基因在成功甲基化（67个,D）和去甲基化（77个,E）后，分别有11/67（16.4%，D）和28/77（36.4%，E）的基因转录组升高和降低的饼图和热图，对应从WT_2i到Dnmt3a_OE小鼠胚胎干细胞以及从WT_Serum到DKO（Dnmt3a/3b DKO）的DNA甲基化/转录组变化。

F. 基于先前研究,E6.5-E8.5野生型和三敲除胚胎表型示意图。

G. E6.5野生型和三敲除外胚层之间启动子DNA甲基化水平柱状图。

H. RNA-seq数据中E6.5野生型和三敲除外胚层的主成分分析。

1. 饼图和热图显示来自P4的基因在成功去甲基化后（81个）；其中28/81（24.7%）的基因观察到转录组降低，对应从E6.5野生型到三敲除外胚层的DNA甲基化/转录组变化。

图6：PPT过程中可能促成DNA甲基化-转录组正相关模式假设机制

1. EPI中DNA甲基化-转录组正相关模式（P4）热图。
2. PPT过程中EPI内mP4位点的DNA甲基化和转录组基因组浏览器快照。
3. 鉴定mP4启动子差异甲基化区域中富集的转录因子motif示意图。
4. P4启动子差异甲基化区域中的motif富集分析。
5. 富集分析显示在mP4启动子中富集了80个特异性转录因子结合motif。
6. Myl7基因的DNA甲基化、转录组和ATAC peak信号基因组浏览器快照。
7. 非经典模型启动子高甲基化可能招募激活因子，并在PPT过程中激活未甲基化且转录沉默的基因转录。
8. 内细胞团中八个基因启动子处的CTCF信号热图。
9. 内细胞团和外胚层中Myl7位点周围的ATAC、H3K27ac、Hi-C、增强子-启动子互作、CTCF CUT&RUN信号（内细胞团）、CTCF和CTCF(L)motif的基因组浏览器快照。
10. 启动子高甲基化可能拮抗CTCF，并在绝缘子活性丧失后激活增强子-启动子互作。
11. 从内细胞团到外胚层过程中，mP4基因的基因体和启动子处五种染色质标记（H3K4me3、H3K27me3、H3K27ac和ATAC）的动态变化。
12. 内细胞团和外胚层中Myl7位点周围DNA甲基化、H3K4me3、H3K27me3、H3K27ac和ATAC信号的基因组浏览器快照。
13. 随着启动子DNA甲基化增加，非经典宽H3K4me3 peak在部分基因体和启动子区减少。H3K27me3在启动子区沉积。
14. 启动子DNA甲基化升高伴随H3K27ac在基因体和启动子处富集，染色质转为开放状态。

参考文献：
Zhu Q, Liu Y, Hao X, Yan S, Ge J, Zheng C, Ren X, Zhou F. Dissecting pre- to post-implantation transition of DNA methylome-transcriptome dynamics in early mammalian development. Cell Rep. 2025 Jun 3;44(6):115790. doi: 10.1016/j.celrep.2025.115790