单细胞转录组(scRNA‑seq)、单细胞染色质可及性测序(scATAC‑seq)、单细胞蛋白组等单细胞组学技术,已经成为解析组织细胞异质性、挖掘稀有细胞亚群、疾病细胞分子机制、药物作用细胞图谱的核心科研手段。所有单细胞测序技术的实验起点,均是高质量的单细胞悬液。样本解离制样环节如果把控不到位,会直接出现细胞活率低、大量细胞碎片、细胞团聚黏连等问题,会造成后续测序数据严重失真,直接导致整个单细胞项目失败。只有标准化组织解离‑单细胞悬液制备全流程质控体系,从源头规避制样风险,保障单细胞测序项目稳定输出可靠数据。
一、单细胞悬液关键质控指标及其负面影响
单细胞悬液的核心评价指标包含细胞活率、细胞团聚率、碎片占比、细胞完整度四大维度,任一指标不达标,都会向下游测序环节传导负面影响。
(1)细胞活率
活细胞比例是第一优先级质控指标。死细胞会释放核酸酶、核酸片段,游离核酸会干扰文库构建,提升背景噪音;死细胞占比过高,最终测序数据中死细胞占比高,有效细胞捕获数量大幅下降,有效测序数据被大量消耗在死亡细胞上,增加测序成本,还会产生大量伪基因表达信号,干扰细胞分群、差异基因分析。
(2)细胞团聚(双细胞 / 多细胞团块)
细胞团是 2 个或者多个细胞黏连在一起形成聚合体。微流控单细胞捕获芯片的微孔 / 油滴体系无法将团块拆分成单个细胞。一个孔位捕获多个细胞,形成双细胞(doublet)/ 多细胞(multiplet)。数据分析阶段无法完全过滤掉全部双细胞,会产生假的混合细胞亚群,错误的基因表达谱,直接干扰细胞类型注释、通路富集分析,造成结论误判。
(3)细胞碎片占比
组织解离过程中细胞破损会产生大量细胞碎片,碎片含有游离 RNA/DNA。碎片会竞争占据芯片微孔位置,挤占有效细胞捕获空间,降低有效细胞产出,提升背景信号,降低测序数据信噪比。
(4)细胞完整度
细胞形态完整,细胞膜不破损。细胞膜破损之后胞内核酸外泄,不仅提升背景,同时该细胞本身也失去测序分析价值。
总结:活率不足、细胞团聚、碎片过多,下游单细胞测序直接翻车,即便增加测序深度,也无法挽回制样环节带来的固有缺陷。
二、高低质量单细胞悬液直观质控图谱对比
通过荧光活死染色成像与单细胞捕获芯片落孔图,可以直观区分合格与不合格单细胞悬液。
(1)高质量单细胞悬液
1、活死荧光染色图:绝大部分为绿色活细胞;红色死细胞占比很低;细胞形态完整,大小均一,极少碎片,几乎没有细胞抱团黏连。
2、芯片落孔图:绝大多数微孔只落入单个完整细胞;极少出现团块、碎片;细胞形态完整,无大量破碎残骸。
3、质控结果:细胞活率高,团聚率低,碎片少,满足 scRNA‑seq、scATAC‑seq、单细胞蛋白组全部单细胞实验要求,可以上机。

(2)低质量单细胞悬液
1、活死荧光染色图:大量细胞碎片,细胞形态破碎,细胞黏连抱团现象明显,红色死细胞数量显著增多,细胞大小不均一。
2、芯片落孔图:大量微孔落入细胞团块、破碎细胞残骸;很多孔位同时落入多个细胞;碎片充斥大量微孔。
3、质控结果:活率差、团聚严重、碎片含量高。该类样本不建议直接上机测序。强行上机会出现有效细胞数目少、高双细胞比例、高背景噪音,最终测序数据不可靠。

三、造成单细胞悬液质量差的常见来源
(1)组织取材环节:离体后组织放置时间过长,缺氧、温度不适,细胞发生程序性死亡;组织保存运输条件不达标。
(2)组织解离酶体系:酶组合、酶解温度、酶解时间设置不合理。酶解时间太短,组织消化不开,大量细胞团;酶解过度,细胞膜被破坏,细胞大量死亡,碎片激增。不同组织(脾脏、肝脏、肿瘤、脑组织)最优酶解方案完全不同,需要针对性优化。
(3)机械处理力度:吹打力度过大,机械剪切造成细胞破碎;吹打不足,组织块没有打散,形成细胞团。
(4)样本杂质去除:解离之后没有充分去除细胞碎片、红细胞、脂肪组织杂质,杂质残留影响后续悬液质量。
(5)离心参数:离心转速过高、时间过长,挤压造成细胞破裂;转速过低,细胞沉淀不完全。
重点提示:很多科研人员重视测序上机环节,却忽视前面解离制样。单细胞测序的数据上限,在组织解离制备单细胞悬液阶段就已经决定。后续测序、生信分析手段,只能做数据过滤,不能修复已经破损、死亡、抱团的细胞。
四、小结
单细胞测序不是 “上机就可以拿到好数据”。单细胞悬液制备是整个单细胞组学最关键的前置瓶颈步骤。活细胞比例、细胞团聚率、碎片含量直接决定最终测序质量。制样环节出现的损伤,无法依靠后期增加测序深度或者生信分析补救。选择具备完整制样‑质控‑测序‑生信全流程服务平台,重视前期解离质控,是单细胞项目获得可靠实验数据的重要保障。
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提示:不同组织的解离难度差异很大,肿瘤、脑组织、纤维化组织对酶解条件要求高,建议前期提前沟通样本类型、样本保存运输条件,最大化保障制样成功率。
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单细胞测序样本前处理:单细胞悬液制备质量决定测序项目成败