1、培养基成分的影响
在抗菌药物敏感性试验中，培养基的质量十分关键。培养基中的游离电解质会影响少数抗菌药物的敏感性。因此，需对Mueller Hinton琼脂培养基的成分进行监测，确保Ca⁺⁺、Mg⁺⁺等二价阳离子的含量在可接受范围内。Ca⁺⁺和Mg⁺⁺含量过高会导致氨基糖苷类和四环素类药物活性降低，Ca⁺⁺和Mg⁺⁺含量过低则会使其活性增强。
如果Mueller Hinton琼脂培养基中含有过量的胸腺嘧啶或胸苷，则会抵消某些抗菌药物的作用，如磺胺类药物、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑等，从而形成较小的或者不太清晰的抑菌圈，甚至不会形成抑菌圈，进而导致假耐药结果。如果磺胺类药物、甲氧苄啶、甲氧苄啶-磺胺甲恶唑对粪肠球菌ATCC 29212的抑菌圈直径≤20 mm，则可以判定培养基中含有高浓度的胸腺嘧啶或胸苷。Mueller Hinton琼脂培养基中的胸腺嘧啶和胸苷含量较低，因此可用于研究抗菌药物的敏感性。
2、培养基的pH值
在纸片扩散法中，制备的培养基的pH值是一项重要参数。根据美国临床和实验室标准协会 (CLSI) 的规定，制备的培养基的pH值应在可接受的范围内，即7.2至7.4之间。如果pH值超出规定的参数范围，则抑菌圈大小将发生变化，变化程度取决于抗菌药物的类别。
例如，pH过高将导致青霉素类和四环素类药物抑菌圈缩小，喹诺酮类、大环内酯类和氨基糖苷类药物抑菌圈增大；反之，pH过低会导致青霉素类和四环素类药物抑菌圈增大，喹诺酮类、大环内酯类和氨基糖苷类药物抑菌圈缩小；作为常规质量控制的一环，每个制备批次的培养基均应测定pH值。
3、培养皿中琼脂培养基的厚度
对于抗菌活性，受试菌株的生长速率会影响抗菌药物的扩散速率。因此，建议在标准工作台上倾注平板，以达到4至5 mm的厚度（通常对于150 mm培养皿使用70 mL培养基，对于100 mm培养皿使用25至30 mL培养基，对于90 mm培养皿使用20至25 mL培养基）。培养基厚度的变化会影响抑菌圈的大小，从而产生假阳性或假阴性结果。
例如，如果琼脂层太薄，抗菌药物会扩散得比应有的更远，从而产生更大的抑菌圈。如果琼脂层太厚，抗菌药物的扩散受到限制，则会产生较小的抑菌圈。
4、接种量
药敏试验中，接种量也是最重要的可变因素之一，其对测得的抑菌圈大小有重大影响。当接种量达到临界量时，才可以测定抑菌圈的边缘。如果接种量较大，则达到临界量的时间会较短，并且抑菌圈较小。如果接种量较小，则需要更长的时间才能达到临界量，抗菌药物会进一步扩散而产生更大的抑菌圈。建议使用一种能够产生含适量微生物（即10⁵~10⁶个细胞/mL）的均匀菌悬液制备技术。若接种不当，即使调整了菌液浓度，也可能产生假性结果。接种时应注意正确、均匀地涂布平板以及正确地放置纸片。
5、孵育
恰当的孵育时间和孵育温度对于药敏试验结果的准确性也非常重要。在35℃以上的温度下孵育可能无法检测出耐甲氧西林葡萄球菌。在低于35℃的温度下孵育时，大多数细菌的生长速度变缓；此外，抗菌药物的扩散速度也更慢。环境中CO₂增加会导致pH值降低，从而影响某些抗菌药物的活性。因此，除非受试菌株生长需要CO₂，否则平板应在自然空气中进行培养。因此，在各个阶段都必须对仪器进行校准。
6、纸片的储存
药敏纸片的存储必须遵从生产商的说明，即密封储存在-20℃至+8℃干燥环境中。暂不使用的药敏纸片不要将包装筒开封，并应存放在原包装中，以防受潮。这非常重要，因为众所周知，水分是抗菌药物降解的主要原因。在不使用时，必须将已开封盛有纸片的包装筒冷藏并密封在纸片分配器或其他合适的容器中。包装筒开封后，纸片存放时间应不超过一周；含有β-内酰胺酶抑制剂（例如克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦）的包装筒特别容易受潮，这可能会导致抗菌药物降解。

总结：对于初次接触药敏试验的老师来说，在做实验之前一定要全面考虑到各种影响因素，在实验过程中做到及时避免，这样做出来的实验才能达到一个理想状态。如果实验效果不理想，要分析原因，影响因素有很多，并不一定是药敏纸片出现的问题。河南海美迪生物技术有限公司以上总结出来的因素，希望对实验老师有所帮助。