01背景介绍 
TMT全称为串联质谱标签（tandem mass tag），是基于质谱MS2实现定量的同位素标签^[1]。TMT标记试剂分子包括三个部分：用作MS2/MS3定量的报告离子、与肽段N端或者侧链的赖氨酸结合的胺基反应基团、连接报告离子和氨基反应基团的质量平衡基团。质量平衡基团保证每个TMT分子的总分子量一致，而经碎裂产生的报告离子分子量各有不同。因此，可以根据各自的标签实现不同样品中相同多肽的定量比较。在母离子碎裂过程中，报告离子同时断裂，相应多肽的丰度便可以报告离子比值来表示。TMT定量方法目前最高可达18标，可用于多条件比较，且定量稳定性好，在蛋白质组学定量中得到广泛应用。PEAKS Online支持TMT MS2/MS3定量分析及结果可视化。

02案例研究目的
仪器和数据采集方法的改进极大地促进了多通路标记的蛋白质组学定量深度。本数据案例^[2]中，作者在Thermo Eclipse上使用三种不同的数据采集方法对相同的样本分别分析，以展示real-time search (RTS)采集方法的优势。

图1 定量分组

03实验设计
分别提取11种人类细胞系(RKO, A549, U87 MG, HCT116, HEK293T, HeLa, MCF7, U2OS, SUM159, PANC1, and Jurkat)的全蛋白提取、还原烷基化、Trypsin/LysC酶切，酶解肽段用TMT11plex试剂盒完成标记后等量混合，然后通过高pH反向HPLC分为96个馏分，最终合并为24个，然后选择互不相邻的12个样本在Eclipse上完成上机。数据采集使用了三种模式：MS2，SPS MS3，RTS-SPS-MS3。

图2 文献实验设计

04数据分析
我们下载了原文献中的36个质谱原始数据（MS2，SPS MS3，RTS-SPS-MS3各12个,SPS MS3只选择90min梯度数据），在PEAKS Online中进行分析，定量方法选择软件内置的TMT11pelx（CID/HCD）,样本间的校正选择Auto normalization（Fig 3）。

图3 校正方法

05三种采集方法的鉴定结果对比
从表1和图4可以看出，MS2方法从定性定量到的蛋白、肽段数量上看，均优于MS3的方法，但是据先前报道所述，MS2的定量准确性比MS3低 ^[3]。因此我们进行了不同采集方法间不同细胞系之间的定量比值。

图4 三种采集方法定性定量结果对比

06不同细胞系之间蛋白定量的差异分析
蛋白定量结果展示如图5。我们又深入对比了Human RelA-associated inhibitor（iASPP）在三种采集方法下，不同细胞系之间的TMT定量结果。为了消除偏差，选择该蛋白下的相同肽段用作比较。

图5 蛋白/肽段定量视图

Human RelA-associated inhibitor(iASPP)是一种参与细胞凋亡和转录的调节因子，通过抑制B细胞活化因子 NF-kappa-B和特异性蛋白1 (SP1)，阻断HIV-1病毒的转录。在11个人类细胞系中，SUM159的iASPP丰度最高。然而，三种采集方法在SUM159中获得的iASPP丰度比值存在显著差异(图6)：在RTS-SPS-MS3和SPS-MS3中分别为23.39和18.75，而在MS2采集方法中，该比值仅为7.52。在其他细胞系中也发现了类似的趋势。一定程度上表明，TMT MS3能更准确地揭示标记通道之间的比值。

图6 iASPP在不同细胞系中的定量比值。RKO设置为reference，理论比值为1.

07结论
PEAKS Online能完成各种复杂实验设计的TMT标记定量分析。

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08参考文献
1.Thompson, A. et al. Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry 75, 1895–1904 (2003)

2.Yu, Q. et al. Benchmarking the orbitrap tribrid eclipse for next generation Multiplexed Proteomics. Analytical Chemistry 92, 6478–6485 (2020).
3.Ting, L., Rad, R., Gygi, S. et al. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Methods 8, 937–940 (2011).

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