牙髓间充质干细胞(dental pulp mesenchymal stem cells，DPMSCs)属于被定义较晚的一种间充质干细胞类型，它从健康成人第三磨牙中发现，从此改变了脱落牙齿和拔除智齿作为口腔医疗废弃物的固定标签，并成为MSCs研究的主要来源，变废为宝。

DPMSCs是一种具有高度增殖能力和多向分化潜能的间充质干细胞，具有来源丰富、取材安全方便、不涉及伦理学问题、免疫原性低等优点，在再生医学领域取得了很大进展，具有广阔的应用前景。

国内首个申报牙髓间充质干细胞的注射液的新药临床实验在2020年8月获得临床默示许可，并在今年5月顺利进入II期临床^[2]。该注射液的有效成分是人牙髓间充质干细胞，临床用于治疗慢性牙周炎。
 

应用前景如此广泛，取料获取也不难的
牙髓间充质干细胞
应该如何获得呢？

此前我们已经为大家介绍了一种取材方法
请随我们往下看，
还有另两条罗马大道~

材料准备

· 组织样本: 无龋齿的健康智齿或自然脱落的乳牙。
· 实验试剂:OriCell^®PBS缓冲液(1X), OriCell^®人牙髓间充质干细胞完全培养基, OriCell^®胰蛋白酶细胞消化液（0.25%），OriCell^®I型胶原蛋白酶(0.1%) ，OriCell^®青霉素-链霉素溶液（100X）。
· 器具耗材：细胞培养皿，眼科镊，牙科钳，牙科锤。

牙髓间充质干细胞的获得

1. 将0.1%的I型胶原酶预热至37℃。
2. 将牙髓组织剪碎至1mm2大小，利用离心管收集牙髓组织，常温条件下265g离心力，离心5min。
3. 弃上清，使用5mL的0.1% I型胶原酶重悬牙髓组织，置于37℃水浴中消化20min，期间每5min取出充分摇匀，或者有条件可以使用恒温摇床进行消化。
4. 消化完成后加入等体积的完全培养基，完全混匀消化悬液和完全培养基。
5. 265g离心5min，弃上清，使用预热的OriCell^®人牙髓间充质干细胞完全培养基重悬细胞，接种至培养皿中。
6. 接种完成后尽量不要移动培养皿，72h后观察细胞状态，之后视情况进行换液，待细胞汇集率达80%-90%，即可进行传代。

注意事项
直接贴壁或者胰酶消化法均可获得牙髓间充质干细胞，但是如果使用的实验材料是乳牙，建议使用直接贴壁法，以增加细胞得率。因为乳牙牙髓非常脆弱及松软，且组织较小，使用贴壁法可以尽量减少操作时间，避免步骤过多，牙髓组织有额外损失。

牙髓间充质干细胞的传代
人牙髓间充质干细胞生长至80%-90%融合度时，就应该进行传代。不可让人牙髓间充质干细胞完全融合或者过度融合，否则会出现接触抑制，严重影响细胞生长。

传代操作
1. 将完全培养基、0.25%胰酶预热至37℃。
2. 吸去培养液，用1×PBS洗涤细胞2-3次以去除残留的血清，吸去PBS。
3. 加入适量0.25%胰酶，轻轻旋转培养皿，使胰酶覆盖细胞表面，消化1-2min，显微镜下可见细胞间隙增大、 变圆（以显微镜下所见为消化依据）。用手轻拍培养器皿的壁，当大约有80％细胞脱壁浮起时，立即加入2-3mL完全培养液终止消化。
注意：总的消化时间不可太长。因为对于间充质干细胞来说，其消化脱壁的时间应该较短，难以消化脱壁的细胞可能多数不是间充质干细胞，而是其他的杂细胞。
4. 将细胞移入离心管中，再向培养瓶中加入1×PBS洗1-2次，同样转移至离心管中。
5. 265g离心4min，吸去上清液后用2-3mL完全培养基重悬细胞。
6. 按照细胞量或按照2×10⁴个细胞/cm²的密度接种细胞。
7. 加入完全培养基，在 37℃、5%CO₂、95%相对湿度的培养箱中进行培养。
 

以上就是人牙髓间充质干细胞的提取和传代方案啦，大家都学会了吗？

OriCell^®牙髓间充质干细胞完整解决方案
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参考文献
1. GRONTHOS S，MANKANI M，BRAHIM J，et al.Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)in vitro and invivo.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(25)：13625-13630.

2. 中源协和细胞基因工程股份有限公司关于参股子公司药物进入Ⅱ期临床试验的公告（公告编号：2023-022，2023年5月25日）。