提取RNA实验技术、操作步骤介绍及注意事项
2024-09-30 来源:本站 点击次数:1796细胞中的RNA可以分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类,不同组织总RNA提取的实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白,DNA等杂质,最终获得高纯度RNA产物的过程。
一、RNA提取的使用目的：
通过总RNA提取可获得高纯度及高质量的总RNA,可用于实时荧光定量PCR、Northern blot、microRNA检测、芯片分析, DNA文库构建,基因克隆等实验。RNA用于不同的后续实验,其质量要求不尽相同。
- cDNA文库构建要求RNA完整而无酶反应抑制物残留;
- Northern对RNA完整性要求较高,对酶反应抑制物残留要求较低;
- RT-PCR对RNA完整性要求不太高,但对酶反应抑制物残留要求严格。因此,明确实验目的是进行后续实验的首要条件。
二、RNA提取的方法：
RNA提取常用的方法是Trizol法提取。它的原理是在匀质化或溶解样品中,Trizol试剂可保持RNA的完整性,同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后,裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。
水相转移后,RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后,用乙醇可从中间相沉淀得到DNA,加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
三、提取到质量良好的RNA方法技术：
提取到质量良好的RNA（包括总RNA和mRNA，以下同），概括起来有两种方法，总结如下：
1、检测RNA溶液的吸光度
280、320、230、260nm下的吸光度分别代表了核酸、背景（溶液浑浊度）、盐浓度和蛋白等有机物的值。一般的，我们只看OD260/OD280（Ratio，R）。
1.82.0时，我们认为RNA中蛋白或者时其他有机物的污染是可以容忍的，不过要注意，当你用Tris作为缓冲液检测吸光度时，R值可能会大于2（一般应该是<2.2的）。当R<1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，你可以根据自己的需要决定这份RNA的命运。当R>2.2时，说明RNA已经水解成单核酸了。
如果RNA的量够，可在260nm（A260）用分光光度法测定RNA的得率，1个单位等于40ug/mlssRNA。纯RNA的A260/A280的比值为2.0。A260/A230的比值还表明RNA的纯度，其值小于2.0表明裂解液中有亚硫氰胍和belta-巰基乙醇残留，其值大于2.4，需用乙酸盐，乙醇沉淀RNA。
2、RNA的电泳图谱
一般的，RNA的电泳都是用变性胶进行的，但是根据我的经验，如果你仅仅是为了检测RNA的质量是没有必要进行如此麻烦的实验的，用普通的琼脂糖胶就可以了。
电泳的目的是在于检测28S和18S条带的完整性和他们的比值，或者是mRNA smear的完整性。一般的，如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，我们认为RNA的质量是好的。
以上是我们常用的两种方法，但是这两种方法都无法明确的告诉我们RNA溶液中有没有残留的RNA酶。如果溶液中有非常微量的RNA酶，用以上方法我们很难察觉，但是大部分后续的酶学反应都是在37度以上并且是长时间进行的。这样，如果RNA溶液中有非常微量的RNA酶，那么在后续的实验中就会有非常适合的环境和时间发挥它们的作用了，当然这时你的实验也就完了。
四、RNA提取实验操作步骤：
准备试剂:
氯仿,异丙醇,75℅乙醇,无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)。
操作步骤:
1、匀浆处理
a)植物组织:
以叶片RNA提取为例.取新鲜叶片在液氮中充分研磨或将叶片剪碎后直接在Trizol中研磨,研磨要迅速,最好不要超过1min.,大约100mg 叶片使用1 ml Trizol.
b)动物组织:
以鼠肝脏RNA提取为例.取新鲜或-70℃冻存组织,每50-100mg组织加1ml Trizol,用匀浆仪进行匀浆处理.样品体积一般不要超过Trizol体积的10%.
c)单层培养细胞：
直接在培养板中加入Trizol裂解细胞,每10cm2面积加1ml Trizol.用取样器吹打几次.
注意:Trizol加量根据培养板面积决定,不是由细胞数决定.如果Trizol加量不足,可能导致提取的RNA中有DNA污染.
d)细胞悬液:
离心取细胞,每5-10×106动物、植物和酵母细胞或每107细菌细胞加1ml Trizol。加Trizol前不要洗涤细胞,以免降解mRNA。一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪处理。
e)血液处理:
直接取新鲜的血液,加入3倍体积红细胞裂解液,混匀后室温放置10min,10 000rpm 离心1min。弃上清,收集白细胞沉淀。每1ml血液收集的白细胞沉淀中加入1ml Trizol。
2、将匀浆样品在15-30℃放置5mim,使得核酸蛋白复合物完全分离。
3、可选步骤:4 ℃ 10 000rpm离心10min,取上清。
1）.如果样品中含有较多蛋白、脂肪、多糖或肌肉、植物结节部分等,可离心去除。离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA,上清中含有RNA。处理脂肪组织样品时,上层是大量油脂,应除去。取澄清的匀浆溶液进行下一步操作。
4、每使用1ml Trizol加0.2ml氯仿,盖好管盖,剧烈震荡15s,室温放置3min。如不能涡旋混匀,可手动颠倒混匀2min代替。
5、4 ℃ 10 000rpm离心10-15min,样品会分成三层:红色的有机相,中间层和上层无色的水相,RNA主要在水相中,把水相(约600ul,约为所用Trizol试剂的60%)转移到新管中。(如要分离蛋白质和DNA,可保留黄色的有机相)
6、在得到的水相溶液中加入等体积的异丙醇,混匀,-20℃ 放置20-30min。
2）、植物或动物组织RNA提取中,容易沉淀出大量的蛋白等污染物,导致电泳检测时看不到RNA。可以按以下步骤操作减轻污染:在上清中加入1/2体积的异丙醇,1/2体积的RNA助沉剂,然后进行以下操作。
7、4 ℃ 10 000rpm离心10min,去上清。
3）、离心前RNA沉淀经常是看不见的,离心后在管侧和管底形成胶状沉淀。
8、加入1ml 75%乙醇(DEPC水处理过的水配制)洗涤沉淀。每使用1ml Trizol至少加1ml乙醇。
9、4 ℃ 10 000rpm离心2min,弃上清;短暂快速离心,用移液器小心吸弃上清,注意不要吸弃沉淀。
10、室温放置晾干(不要晾得过干,RNA完全干燥后会很难溶解,大约晾干2-3min左右即可)。加入适量DEPC水(根据实验需要,可加30-100ul水)或0.5%SDS,用枪头吸打几次,充分溶解RNA。如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅ 的去离子甲酰胺溶解,-70℃保存。
RNA提取的注意事项：
1. 从少量样品中提取RNA(1-10mg组织或102-104细胞) :
加800ul Trizol,样品裂解后加氯仿,分层,沉淀RNA前,加5-10ug RNase-free糖原,糖原会与RNA一同沉淀出来,糖原浓度不高于4mg/ml时不会影响反转录cDNA第一链的合成,也不影响PCR反应。
2. 匀浆后,加氯仿前,样品可在-70 ℃放置一个月以上:
RNA沉淀可以保存在75%酒精中,2-8 ℃一个星期或-20 ℃一年以上。如果要长期保存,RNA可以溶解于100%去离子甲酰胺中,-70 ℃长期保存。
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