ELISA实验操作优化事项汇总
2024-10-23 来源:本站 点击次数:625
ELISA实验是一种常用的生物化学实验技术，用于检测蛋白质、抗体、激素等生物分子。优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证ELISA检测结果准确可靠的必要条件。一些细节操作不当就会对试验结果造成很大偏差，因此我们在实验中应注意以下事项：
1. 加样：
不规范的移液操作可能带来0.1％到5％的移液误差，甚至更高！
（1）移液器定期校准：选择密封性好质量可靠的吸头，吸量不准确，直接影响检测结果；
（2）加样前，溶液充分混匀，垂直悬空加入液体，避免加在孔壁上或产生气泡；
（3）加样时避免液体溅出，如有样本溅出，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录；
（4）如果移液器漏气致使加样量不足，可先吸出（尽量吸净）后加入需求量，并做好相应记录，若结果在灰区，需要复核检测；
（5）每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。
2. 试剂盒使用前室温平衡：
温度是ELISA结合反应的重要影响因素，为使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有的试剂平衡至室温，包括检测样本，避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。
3. 标准品的溶解与稀释，严格按说明书要求进行。
ELISA标准曲线是结果计算的尺子，标准品是ELISA实验成功与否的关键点。
（1）标准品短暂离心，让因运输沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。
（2）根据说明书加入一定体积的蒸馏水（或说明书指定溶液），加水后轻柔涡旋震荡，室温静置混匀。
4. 标准品和样本做复孔
为了获得更准确的实验结果，标准品和样本进行复孔检测。
（1）计算平均值，确保实验结果更准确。
（2）解决实验中失误操作造成的跳孔现象。
（3）计算CV值，对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。
5. 温育
(1) 温育时，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。
(2) 根据说明书进行温育，并注意避光需求。在进行室温反应时，若环境温度与规定条件偏差较大，可使用恒温培养箱进行有效温育。
6. 洗涤
（1）手工洗板，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛致使液体返溅；
（2）机器洗板应经常检查冲洗头是否畅通，若被异物堵塞可用纤细针头挑出。并注意维护保养，每天使用后用纯化水或去离子水冲洗管路，保持管路洁净。
（3）洗涤后反应板尽量扣干；扣干使用的吸水材料应为无尘材质，避免污染反应孔；扣干后的反应板立即加液，不能干板太久影响反应。
7. 检测
（1）酶标仪使用前务必预热10~15分钟，使结果更稳定。
（2）长时间高湿度容易损坏酶标仪滤光片，长时间不用酶标仪时，需要定期开机维护，以保证设备性能正常。酶标仪每年均需定期校验，保证测定结果准确。
（3）根据说明书要求在规定波长条件下使用酶标仪进行结果读取。有些说明书规定双波长测定，该方法可以最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。
（4）TMB是ELISA检测中常用的底物，经HRP作用后显蓝色，经酸终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。
1. 加样：
不规范的移液操作可能带来0.1％到5％的移液误差，甚至更高！
（1）移液器定期校准：选择密封性好质量可靠的吸头，吸量不准确，直接影响检测结果；
（2）加样前，溶液充分混匀，垂直悬空加入液体，避免加在孔壁上或产生气泡；
（3）加样时避免液体溅出，如有样本溅出，应用吸水纸轻轻拭干，并做相应记录；
（4）如果移液器漏气致使加样量不足，可先吸出（尽量吸净）后加入需求量，并做好相应记录，若结果在灰区，需要复核检测；
（5）每次加样顺序一致，尤其底物、终止液顺序一致，保证每个孔显色时间相同。
2. 试剂盒使用前室温平衡：
温度是ELISA结合反应的重要影响因素，为使所有样本在一致的温度下反应，实验前务必将所有的试剂平衡至室温，包括检测样本，避免因温度的动力学反应差异而导致ELISA检测结果的不准确。
3. 标准品的溶解与稀释，严格按说明书要求进行。
ELISA标准曲线是结果计算的尺子，标准品是ELISA实验成功与否的关键点。
（1）标准品短暂离心，让因运输沾到管盖、管壁的标准品沉到管底。
（2）根据说明书加入一定体积的蒸馏水（或说明书指定溶液），加水后轻柔涡旋震荡，室温静置混匀。
4. 标准品和样本做复孔
为了获得更准确的实验结果，标准品和样本进行复孔检测。
（1）计算平均值，确保实验结果更准确。
（2）解决实验中失误操作造成的跳孔现象。
（3）计算CV值，对实验的操作和试剂盒的精密度进行评估。
5. 温育
(1) 温育时，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。
(2) 根据说明书进行温育，并注意避光需求。在进行室温反应时，若环境温度与规定条件偏差较大，可使用恒温培养箱进行有效温育。
6. 洗涤
（1）手工洗板，拍板时要垂直，避免交叉污染，用力不能过猛致使液体返溅；
（2）机器洗板应经常检查冲洗头是否畅通，若被异物堵塞可用纤细针头挑出。并注意维护保养，每天使用后用纯化水或去离子水冲洗管路，保持管路洁净。
（3）洗涤后反应板尽量扣干；扣干使用的吸水材料应为无尘材质，避免污染反应孔；扣干后的反应板立即加液，不能干板太久影响反应。
7. 检测
（1）酶标仪使用前务必预热10~15分钟，使结果更稳定。
（2）长时间高湿度容易损坏酶标仪滤光片，长时间不用酶标仪时，需要定期开机维护，以保证设备性能正常。酶标仪每年均需定期校验，保证测定结果准确。
（3）根据说明书要求在规定波长条件下使用酶标仪进行结果读取。有些说明书规定双波长测定，该方法可以最大限度的消除指纹、杂质及不透光的物质对酶标仪读数带来的误差，以保证实验数据的准确度。
（4）TMB是ELISA检测中常用的底物，经HRP作用后显蓝色，经酸终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。
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