摘要：人端粒酶反转录酶（hTERT）基因电转染大鼠前软骨干细胞（PSCs）的效果及其对细胞增殖、分化等特性的影响。通过构建特定的电转染体系，将 hTERT 基因导入大鼠 PSCs，利用多种检测手段分析转染后细胞在分子、细胞及功能层面的变化，为相关组织工程与再生医学研究提供理论依据与实验参考。
一、引言
前软骨干细胞在骨骼发育与修复过程中具有重要作用，其增殖与分化能力影响着骨组织的形成与再生。然而，在体外培养及应用过程中，细胞往往面临增殖能力受限、老化等问题。人端粒酶反转录酶基因与细胞的端粒维持及增殖能力密切相关。将 hTERT 基因导入大鼠前软骨干细胞，有望改善细胞的增殖特性，并进一步探索其对分化能力的潜在调控作用，这对于骨组织工程领域中种子细胞的优化具有重要意义。
二、材料与方法
（一）实验材料
- 实验动物：选取健康的新生大鼠，用于分离前软骨干细胞。
- 主要试剂：包括用于细胞培养的高糖 DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶等；构建 hTERT 基因表达载体所需的质粒提取试剂盒、限制性内切酶、连接酶等；电转染试剂以及用于检测细胞增殖、分化相关指标的抗体、试剂盒等。
（二）大鼠前软骨干细胞的分离与培养
- 细胞分离：在无菌条件下，取新生大鼠的长骨组织，去除骨膜及周围软组织。将骨组织剪成小块，置于含有适量消化酶的溶液中，在 37°C 下振荡消化一定时间。消化完成后，通过离心收集细胞沉淀，用培养基重悬细胞，接种于培养皿中。
- 细胞培养：将接种后的细胞置于 37°C、5% CO₂的培养箱中培养。定期观察细胞生长状态，当细胞融合度达到一定比例时，进行传代培养，选取生长状态良好的第 2 - 3 代细胞用于后续实验。
（三）hTERT 基因表达载体的构建
- 根据 hTERT 基因序列设计特异性引物，通过 PCR 技术扩增目的基因片段。
- 将扩增得到的 hTERT 基因片段与合适的载体质粒进行酶切处理，然后利用连接酶将两者连接，构建重组表达载体。
- 将构建好的重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞中，通过筛选、鉴定获得阳性克隆，提取重组质粒并进行纯度与浓度检测。
（四）电转染实验
- 细胞准备：取对数生长期的大鼠前软骨干细胞，离心收集细胞，用预冷的电转染缓冲液重悬细胞，调整细胞密度至合适浓度。
- 电转染体系构建：将一定量的重组 hTERT 基因质粒与细胞悬液混合均匀，加入到电转染杯中，设置合适的电转染参数，如电压、电容、脉冲时间等。
- 电转染操作：将电转染杯置于电转仪中进行电脉冲处理，处理完成后，将细胞转移至含有新鲜培养基的培养皿中，在培养箱中继续培养。
（五）转染后细胞的检测与分析
- 基因表达检测：采用实时荧光定量 PCR（qRT - PCR）技术检测转染后细胞中 hTERT 基因的 mRNA 表达水平，以未转染细胞作为对照，分析基因转染效率。
- 端粒酶活性检测：利用端粒酶活性检测试剂盒测定转染后细胞的端粒酶活性变化，通过与未转染细胞对比，评估 hTERT 基因对端粒酶活性的影响。
- 细胞增殖能力检测：采用 CCK - 8 法检测转染后细胞在不同时间点的增殖情况，绘制细胞增殖曲线，观察 hTERT 基因转染对大鼠前软骨干细胞增殖能力的改变。
- 细胞分化能力检测：在特定的诱导分化条件下，培养转染后的细胞，通过检测成骨分化相关标志物（如碱性磷酸酶活性、骨钙素表达等）以及成软骨分化相关标志物（如 Aggrecan、Col2a1 表达等），分析 hTERT 基因转染对细胞分化能力的影响。
三、结果
（一）hTERT 基因表达载体的鉴定
经过酶切鉴定与测序分析，证实成功构建了 hTERT 基因重组表达载体，其序列与预期一致，可用于后续电转染实验。
（二）电转染效率及基因表达检测
qRT - PCR 结果显示，转染后细胞中 hTERT 基因的 mRNA 表达水平显著高于未转染细胞，表明电转染成功将 hTERT 基因导入大鼠前软骨干细胞，且具有较高的转染效率。
（三）端粒酶活性变化
端粒酶活性检测结果表明，转染 hTERT 基因后的大鼠前软骨干细胞端粒酶活性明显增强，与未转染细胞相比具有显著差异，说明导入的 hTERT 基因有效激活了细胞的端粒酶活性。
（四）细胞增殖能力
CCK - 8 法检测的细胞增殖曲线显示，转染 hTERT 基因的大鼠前软骨干细胞增殖速度明显加快，在培养后期仍能保持较高的增殖活性，而未转染细胞增殖逐渐减缓并趋于稳定，表明 hTERT 基因转染显著提高了细胞的增殖能力。
（五）细胞分化能力
在成骨分化诱导条件下，转染 hTERT 基因的细胞碱性磷酸酶活性及骨钙素表达在一定时间内与未转染细胞无明显差异，但随着培养时间延长，转染细胞的成骨分化相关指标有升高趋势；在成软骨分化诱导条件下，转染细胞的 Aggrecan 和 Col2a1 表达水平与未转染细胞相比，在早期变化不显著，后期有一定程度的增加，提示 hTERT 基因转染对大鼠前软骨干细胞的分化能力可能存在一定的延迟性影响。
四、讨论
本研究成功地将人端粒酶反转录酶基因电转染大鼠前软骨干细胞，通过一系列检测手段证实了转染后细胞在基因表达、端粒酶活性、增殖能力等方面发生了显著变化。在细胞分化能力方面，虽然早期影响不明显，但后期出现的相关标志物表达变化表明 hTERT 基因可能在细胞分化进程中发挥着潜在的调控作用，其具体机制有待进一步深入研究。
电转染技术作为一种高效的基因导入方法，在本实验中展现出较好的效果，但在操作过程中，电转染参数的优化对于提高转染效率和减少细胞损伤至关重要。此外，本研究为进一步探索 hTERT 基因修饰的前软骨干细胞在骨组织工程中的应用提供了实验基础，例如在构建组织工程骨时，利用转染后的细胞可能提高种子细胞的数量与活性，从而促进骨组织的再生与修复。然而，在将其应用于临床实践之前，还需要对细胞的安全性、免疫原性等多方面进行全面评估，以确保其在再生医学领域的有效性与可行性。
综上所述，本研究的成果为骨组织工程领域中前软骨干细胞的基因修饰研究提供了有价值的参考，有望推动相关领域在细胞治疗与组织再生方面取得进一步的发展。
