普通PCR和荧光定量PCR的引物设计方面比较
2025-02-27 来源:本站 点击次数:372
引物，在核苷酸聚合作用的起始时，可以刺激合成另一种大分子，并与反应物以共价键形式连接的序列。在核酸化学中，引物是一段短的单链RNA或DNA片段，可结合在核酸链上与之互补的区域，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3′端开始合成新的核酸链。无论是做普通PCR还是荧光定量(Real time)PCR，设计合适的引物是非常关键的一步。
普通PCR和荧光定量PCR的检测方式具有较大的差别。荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光，普通PCR通过检测插入DNA中核酸染料的量来测定PCR最终产物量。荧光定量PCR可以通过扩增曲线进行精确定量，普通PCR则是通过电泳的方式进行定性分析。那么在普通PCR和荧光定量PCR的引物设计方面，有什么相同和不同处呢？
相同处：
1、序列的查找是一致的；
2、序列选取应在基因的保守区段；
3、选取合适的扩增片段大小
4、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；
5、避免引物自身形成环状发卡结构；
6、Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；
7、引物之间的TM相差避免超过2℃；
8、引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；
不同处：
Real time PCR 引物
1、PCR 产物长度；real-time PCR要求在300bp以内，一般选80-150bp 之间；
2、多对目的基因同时扩增，文献上查来的引物条件会不同，需要设计尽可能条件一致的引物；
3、目的基因含量比较低时，需要设计灵敏度比较高的引物；
4、相对电泳法，Real time PCR灵敏度比较高，对引物的要求更高，引物二聚体要少；熔解曲线要求单一产物；
5、Real time PCR的目的是进行定量或者相对定量，对扩增的效率有要求；对引物的二级结构要求高；
普通PCR 引物：
1、根据实验的要求不同，长度一般是从150bp到几千bp 不等；
2、对二级结构要求没有real time PCR 高；
3、对扩增效率要求不高；
4、可以选用梯度PCR 仪，选择不同退火温度，对引物退火温度要求不需要一致；
验证时不同：
引物的特异性（相同点）：
引物的特异性在使用前用blast 来保证；
不同点：
real time PCR在实验结果中通过熔解曲线来验证；
PCR的特异性产物峰应与引物报告中的PCR product 相差在两度之内；
普通PCR 通过产物的长度，跑条带，来鉴别产物的特异性；
Real time PCR 可以通过扩增曲线，熔解曲线分析来鉴别产物的相对量，同时也可以对终产物进行电泳分析，更全面，更科学！
普通PCR和荧光定量PCR的检测方式具有较大的差别。荧光定量PCR实时监测与DNA结合的荧光染料激发的荧光，普通PCR通过检测插入DNA中核酸染料的量来测定PCR最终产物量。荧光定量PCR可以通过扩增曲线进行精确定量，普通PCR则是通过电泳的方式进行定性分析。那么在普通PCR和荧光定量PCR的引物设计方面，有什么相同和不同处呢？
相同处：
1、序列的查找是一致的；
2、序列选取应在基因的保守区段；
3、选取合适的扩增片段大小
4、避免引物自身或与引物之间形成4个或4个以上连续配对；
5、避免引物自身形成环状发卡结构；
6、Tm值在55－65℃，GC含量在40%－60%；
7、引物之间的TM相差避免超过2℃；
8、引物的3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基；
不同处：
Real time PCR 引物
1、PCR 产物长度；real-time PCR要求在300bp以内，一般选80-150bp 之间；
2、多对目的基因同时扩增，文献上查来的引物条件会不同，需要设计尽可能条件一致的引物；
3、目的基因含量比较低时，需要设计灵敏度比较高的引物；
4、相对电泳法，Real time PCR灵敏度比较高，对引物的要求更高，引物二聚体要少；熔解曲线要求单一产物；
5、Real time PCR的目的是进行定量或者相对定量，对扩增的效率有要求；对引物的二级结构要求高；
普通PCR 引物：
1、根据实验的要求不同，长度一般是从150bp到几千bp 不等；
2、对二级结构要求没有real time PCR 高；
3、对扩增效率要求不高；
4、可以选用梯度PCR 仪，选择不同退火温度，对引物退火温度要求不需要一致；
验证时不同：
引物的特异性（相同点）：
引物的特异性在使用前用blast 来保证；
不同点：
real time PCR在实验结果中通过熔解曲线来验证；
PCR的特异性产物峰应与引物报告中的PCR product 相差在两度之内；
普通PCR 通过产物的长度，跑条带，来鉴别产物的特异性；
Real time PCR 可以通过扩增曲线，熔解曲线分析来鉴别产物的相对量，同时也可以对终产物进行电泳分析，更全面，更科学！
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