文献来源：Hubel A, et al. Storage of Human Biospecimens: Selection of the Optimal Storage Temperature[J]. Biopreservation and Biobanking,2014.

做科研、建生物样本库，我们几乎每天都在和低温冰箱打交道。血清、组织、细胞、核酸，不同样本一股脑丢进80℃冰箱就万事大吉？很多人不知道：储存温度直接决定生物标志物的长期稳定性，选错温度，样本放得再久也只能得到失真甚至完全错误的实验数据。

今天我们结合经典生物保藏综述，聊聊人体生物样本低温储存背后的物理、生物学逻辑，以及不同类型样本该如何选择储存温度。

一、不是冻上就安全：低温储存背后的两个核心机制

很多人以为冷冻=完全停止一切生化反应，但事实并非如此。文章指出，样本冷冻保存的本质，是通过低温改变水的物理状态，同时抑制样本内降解酶的活性，从而保护蛋白、核酸、细胞结构等生物标志物。

1. 水的行为：结冰、成核与玻璃化转变

生物样本是水、盐、蛋白组成的复杂混合体系，不会在某一个固定温度瞬间完全冻结，而是在一个温度区间逐步结冰。 样本发生结冰（成核）往往发生在5℃~15℃，结冰之后水形成冰晶，盐、蛋白、细胞会被挤压到冰晶之间未冻结的液相缝隙里。随着温度继续降低，剩余未冻溶液溶质浓度急剧升高，渗透压甚至可达10000 mOsm，会造成蛋白聚集、细胞损伤。

当体系达到玻璃化转变温度Tg，体系变成高黏度的玻璃态，分子运动近乎停滞。如果储存温度高于Tg，体系内部仍存在可运动的未冻水，水分子依然可以参与化学反应，降解反应依旧会缓慢进行。

划重点：只要样本内部还有可移动的液态水，降解就不会彻底停止。

2. 低温≠酶活性完全消失

样本本身自带蛋白酶、核酸酶、脂肪酶等各类降解分子。酶促反应速率服从阿仑尼乌斯（Arrhenius）动力学：温度降低，反应速率常数下降，但不等于反应完全归零。 研究发现，部分蛋白即使在80℃以下，依旧能检测到酶活性。RNase A、β葡萄糖苷酶等蛋白，在70~93℃区间仍保留一定的催化能力。 也就是说：80℃可以大幅减慢降解，但并不能让所有降解酶彻底休眠。长期储存，部分敏感标志物依旧会慢慢降解。

因此，理想储存温度需要满足两点：①让体系尽量接近玻璃态，抑制水分子迁移；②低于目标生物标志物对应的酶活性阈值温度。

二、各类人体生物样本储存案例：温度不同，结局千差万别

文章汇总了大量人体体液、细胞、组织样本的储存研究，不同标志物对温度耐受差异极大，部分标志物20℃几天就发生明显降解；也有部分标志物在25℃仍可稳定储存多年。

（1）体液样本（血清、血浆、尿液、脑脊液等）

体液样本是生物库最常见样本，里面包含蛋白、激素、维生素、细胞游离DNA等大量标志物，不同分析物稳定性差异巨大，不能一概而论。

1.不适合20℃长期储存的标志物

• VEGF（血管内皮生长因子）：血清反复冻融后，20℃、75℃储存下水平显著下降；
• MMP9（基质金属蛋白酶9，心血管风险标志物）：80℃储存24个月，含量仅剩初始65%；储存43个月，仅剩1%；
• 维生素C：血浆样本20℃条件下仅1天就发生明显降解，建议70℃及以下储存；
• 部分肿瘤抗原CA125、CA153：血清25℃储存10年，检测浓度出现15%升高，发生分析物偏移。

2.相对耐受较高温度的标志物

• MMP7：血清20℃储存5年仍保持稳定；根据阿仑尼乌斯方程推算，75℃条件下可稳定上百年；
• 载脂蛋白：80℃储存4年浓度无显著变化；20℃短期3个月也可稳定；
• CTXI（骨吸收标志物）：20℃、80℃、150℃，3年储存均可保持稳定；
• 部分甲状腺指标：TSH、fT3，25℃储存最长23年浓度几乎不受影响，但fT4、甲状腺自身抗体会随储存发生波动。

小结：20℃不适合大多数敏感蛋白标志物长期储存。如果研究对象是金属蛋白酶、细胞因子、维生素类，优先80℃；对稳定性未知的标志物，条件允许可以选择液氮气相（150~196℃）。

��（2）冻存细胞样本（造血干细胞、PBMC、原代细胞、细胞球）

细胞样本储存，除了看存活率，更要看克隆形成能力、膜完整性、长期增殖潜能，很多样本80℃短期看活率尚可，长期储存功能持续下滑。

1. 造血祖细胞：80℃储存，细胞复苏活率随时间持续下降，1个月活率约80%，31个月下降至32%；

2. 外周血祖细胞：80℃储存12年，膜完整性、克隆形成能力相比＜170℃液氮组出现显著下降；

3. 海藻酸包裹肝细胞球：80℃储存仅1个月活度就大幅衰减，12个月几乎丧失功能；而170℃储存12个月依旧维持细胞活性；

4. 骨髓、部分造血干细胞：液氮气相（140℃~190℃）长期储存，细胞活率、集落形成能力可以很好保留；部分研究显示特定冻存保护剂条件下90℃也可实现数年稳定储存，但不推荐超长期使用80℃保存干细胞用于细胞治疗。

小结：部分细胞可短期80℃，但功能敏感细胞、干细胞，超长期储存优先液氮气相（＜135℃）。

（3）组织样本（肿瘤、心脏瓣膜、皮肤、生殖组织等）

组织样本存在细胞外基质，冰晶更容易沿着血管、组织间隙生长，破坏基质结构。DNA、RNA、蛋白、受体的稳定性各不相同。

1. DNA vs RNA：80℃冻存人体多种组织，DNA约80%样本可维持高质量，RNA仅60%样本质量合格；DNA比RNA更耐受储存；

2. 心脏瓣膜移植物：80℃储存，成纤维细胞活率随时间逐步丢失；24周后组织功能仅剩15%；而＜135℃液氮储存12年，成纤维细胞蛋白合成功能得到保留；

3. 生殖组织甾体受体：液氮196℃储存28周，受体不再发生进一步丢失；

4. 部分乳腺肿瘤雌激素受体：短期100天内20℃储存可满足常规检测，但不代表全部组织标志物都适用这个结论。

小结：部分蛋白受体短期20℃可用；但如果要同时保留组织细胞活性、RNA、多种蛋白标志物，长期储存推荐135℃以下液氮气相储存。

三、没有万能温度！样本库该如何做质控

文章特别提醒：我们很难对每一份样本都实测水的流动性和酶活性，因此一套完善的质控体系是样本库的刚需。

1. 设置专用质控样本：不和实验分发样本混用，冻存前、冻存后不同时间点检测目标标志物；如果标志物随储存时间持续降解，说明当前储存温度不足，需要转移至更低温度。

2. 区分「冷冻本身造成损伤」和「储存过程造成损伤」：例如乳酸脱氢酶，冷冻这个操作本身就会让酶完全失活，不要误判为储存温度的问题。

3. 细胞样本不能只看复苏即刻活率：冻存损伤带来的凋亡，是复苏后一段时间逐步显现的，需要延后评估细胞功能。

四、实操总结速查表

简单记住几条原则：

1. 20℃适合少数稳定标志物，绝大多数生物样本不建议20℃长期储存；

2. 80℃可以满足大部分科研，但对金属蛋白酶、细胞因子、干细胞，长期仍存在降解风险；

3. 追求最大程度保留全部生物信息，优先液氮气相储存；

4. 储存温度的选择，要匹配你后续要检测的标志物，而不是统一一刀切。

写在最后

生物样本库的核心价值，在于保留样本采集那一刻真实的生物学信息。很多课题组投入大量经费收集样本，却忽略储存温度的选择，多年之后开展实验，才发现标志物已经发生降解、偏移，所有样本失去科研价值。

冷冻不等于“时间暂停”，低温只是减慢时间。选择储存温度，不能凭经验习惯，而要基于目标分析物的稳定性来决定。

你的实验室样本都存在哪个温度？

遇到过标志物降解的坑吗？

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参考文献：
Hubel A, Spindler R, Skubitz A P N. Storage of Human Biospecimens: Selection of the Optimal Storage Temperature[J]. Biopreservation and Biobanking, 2014, 12(3):165175.