Caco-2源自人结直肠腺癌组织，是药物肠道吸收、转运与毒理学研究中最经典的上皮细胞模型。该细胞呈上皮样贴壁生长，培养中常见岛状聚集与含液泡的巨大细胞均属正常现象。经长期培养可自发分化为具有刷状缘和紧密连接的极化肠上皮单层，并表达多种转运体与代谢酶，因此也广泛用于肠道吸收机制、跨膜转运及口服药物渗透性评价。该细胞贴壁较慢，对血清比例与消化条件较敏感，培养中需重点把控密度、血清质量与消化时间。
一、细胞复苏
1.【准备工作】配制完全培养基：MEM改良Eagle培养基（abs9467-500ml/SV30308.01）+20% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010），取9mL完全培养基于37℃预热。水浴锅预热至37℃；生物安全柜紫外照射30min。
2.【融化】从液氮/冰箱取出冻存管，37℃水浴快速摇晃融化，约1-2min。
3.【重悬】75%酒精擦拭冻存管外壁，安全柜内开盖，将细胞悬液沿管壁缓慢滴入含9mL预热完全培养基的离心管中，避免直接冲击，轻柔混匀。
4.【离心】300×g离心5min，弃上清，去除DMSO残留。
5.【重悬】加入1-2mL完全培养基轻轻吹打重悬；接种T25培养瓶（加入6-8mL完全培养基），十字混匀，标注名称、代次、日期。
6.【培养】放入37℃、5%CO2培养箱静置培养；Caco-2贴壁较慢，复苏后24-48h换液，去除死细胞碎片，避免频繁扰动。
二、细胞传代
1.【实验准备】配制完全培养基：MEM改良Eagle培养基（abs9467-500ml/SV30308.01）+20% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010）。提前取出PBS（abs962-500ml/SV30305.01）、完全培养基、0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01），恢复至室温；生物安全柜提前使用紫外照射30min。
注意：Caco-2对血清比例敏感，血清浓度低于20%时贴壁时间明显延长甚至不贴壁，建议固定批号并使用优级胎牛血清（abs972-500mL/SV30302.03）；NEAA和L-谷氨酰胺为维持上皮表型与分化的必要添加物，如基础培养基中缺少则需额外添加，含量建议：1% NEAA、2 mM L-谷氨酰胺。
2.【镜检】融合度达70%-80%、细胞铺展饱满即可传代；过度融合加速细胞老化并改变形态。
3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，沿瓶壁缓慢加入2-3mL PBS（abs962-500ml/SV30305.01），轻摇覆盖，吸弃。
4.【细胞消化】加入0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01）覆盖瓶底，37℃消化5-10min，镜下见大部分细胞变圆、轻晃瓶壁有细胞脱落即加等量完全培养基终止。
注意：Caco-2易聚集、贴壁牢，消化需充分但不可过久，尽量吹打成单个细胞、避免剧烈吹打，以减少细胞损伤与成团。
5.【离心】300×g离心5min，弃上清；加入完全培养基轻轻吹打10-15次重悬。
6.【传代】按1:2-1:4接种至新瓶（Caco-2接种密度不宜过低），补加完全培养基至工作体积，十字混匀，标注信息。
7.【镜检】镜下确认分散均匀，放入37℃、5%CO2培养箱，48h后再观察细胞状态。
注意：Caco-2接种后48h内不换液、不扰动，以利于贴壁；常规每2-3天换液一次。细胞常呈岛状聚集生长，细胞群中出现的含液泡巨大细胞及少量黑色颗粒为正常现象，并非污染；用于分化/转运实验时建议使用低代次细胞（≤P55，核心分化实验≤P40），高代次细胞分化能力与转运体表达会明显下降。
三、细胞冻存
1.【准备工作】冻存液：无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）或90% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+10% DMSO（abs9187-100mL）；冻存管标注名称、代次、冻存人、日期；安全柜紫外照射30min。
2.【细胞收集】融合度70%-80%时按传代步骤消化收集，300×g离心后弃上清。
3.【细胞重悬】加入冻存液（约1mL/管）轻柔吹打重悬，细胞密度约1-5×10⁶/mL。
4.【冻存】每管1mL入冻存盒，-80℃过夜后转移至液氮罐长期保存；建议尽早冻存低代次（≤P40）细胞作为种子库，保证分化实验结果可重复。
四、关键注意事项
1.密度与消化
（1）融合度70%-80%传代，过度融合加速老化、形态改变；
（2）胰酶消化5-10min，尽量消化为单个细胞，吹打温和，避免成团与损伤；
（3）接种密度不宜过低，传代比1:2-1:4，过低贴壁差、恢复慢。
2.贴壁与初期管理
（1）复苏/传代后贴壁较慢，48h内不换液、不扰动；
（2）部分细胞漂浮、出现碎片属正常现象，会以岛状形态贴壁并逐渐铺展；
（3）换液频率2-3天/次，保持培养环境稳定，避免频繁全换液。
3.培养基与血清选择
血清比例是Caco-2贴壁与分化的关键，血清低于20%易贴壁不良。
4.形态与污染判断
（1）正常：上皮样铺路石样、岛状聚集、边界光滑，可见含液泡巨大细胞与少量黑色颗粒；
（2）异常：形态不规则、大量漂浮、碎片增多、培养基浑浊（污染）。
5.分化与转运实验要点
（1）Caco-2可自发分化为肠上皮细胞，用于吸收/转运实验时以Transwell多孔膜培养，接种约1×10⁵ cells/cm²；
（2）分化成熟需约21天（前7天每48h换液、之后每日换液），以TEER值＞300-450 Ω·cm²作为单层致密性判据；
（3）实验应使用低代次细胞并控制传代历史一致，避免代次差异导致转运体表达与渗透性结果波动。
参考资料
ATCC