体外血脑屏障（BBB）模型构建实操步骤与避坑要点
2026-10-30 来源:启达生物 点击次数:42
血脑屏障（BBB）模型是神经药理、药物跨脑递送研究里十分经典的体外模型，但很多科研伙伴在搭建Transwell共培养模型时，常常遇到屏障渗漏、细胞状态差、融合不均匀等问题。本文结合实操经验，给大家整理一套完整可落地的BBB模型构建方案，附细胞、培养基选型与关键避坑要点。
一、实验材料选型
实验细胞
1. HBMEC 人脑微血管内皮细胞（货号：CD5177）
血脑屏障的核心组成细胞，负责阻挡可溶性物质、细胞从血液循环进入脑组织，表达特异性粘附分子，是构建屏障单层的主力细胞，具备脑血管内皮的组织特异性。
2. HPBC 人脑血管周细胞（货号：CD5022）
取自成人正常脑组织，经α-SMA免疫荧光鉴定；周细胞是维持微血管稳定、调控血管形成的关键细胞，搭配内皮细胞共培养，能显著提升BBB模型的屏障紧密性。P3代使用，配套专用培养基可实现10倍扩增。
细胞永生化小提示：原代细胞传代次数有限，可采用hTERT进行永生化改造，改造后细胞可稳定传40代以上，37℃常规培养即可；SV40改造成本更低，但大多需要33℃低温增殖。永生化细胞培养全程需添加终浓度4μg/mL的Blasticidin S HCI筛选，持续维持永生化性状。
配套培养基
1. ECGM内皮细胞培养基（货号：P1001）
低血清完全培养基，经过多部位人源内皮细胞验证优化；无支原体、无内毒素，添加肝素、内皮生长因子、胰岛素、抗氧化剂、皮质醇等组分，适配原代内皮以及永生化内皮细胞株。
2. PGM周细胞培养基（货号：P4001）
专门针对脑血管周细胞设计，规避周细胞和血管平滑肌细胞、成纤维细胞混淆的痛点；配方添加MB、B27、N2等生长因子，维持周细胞表型稳定，满足长期培养需求。
3. AGM星形胶质细胞培养基（货号：P2701）
适配原代星形胶质细胞体外培养，血清含量2%，含TGF、PDGF等生长因子，搭配抑制杂细胞增殖的添加物，适合星形胶质细胞培养，可用于更复杂的三细胞BBB共培养体系。
二、Transwell BBB模型详细操作步骤
1. 提前准备24孔Transwell培养板、ECGM培养基、包被液，所有试剂提前室温预热。
2. 超净台内拆开培养板，取200μL包被液（或稀释胶原酶）对小室半透膜进行包被处理。
3. 包被完成后吸出包被液，每孔加入200μL ECGM培养基，放入细胞培养箱预热备用。
4. 细胞消化收集（以T75瓶举例）：取出培养瓶，DPBS清洗；加入4 mL 0.05%胰蛋白酶，37℃消化3–5 min，镜下观察细胞变圆透亮、轻拍瓶壁脱落，立刻加入含血清完全培养基终止消化，1000 rpm离心5 min收集细胞沉淀。
5. 台盼蓝染色计数：取细胞悬液和台盼蓝1:1混匀，加至计数板，统计活细胞密度。
6. 细胞接种：HBMEC和HPBC按照1:1比例混合，调整细胞密度至1.6×10⁵个/mL，每小室接种500 μL细胞悬液。
分区说明：Transwell上室=血液侧，下室=脑侧；两种细胞共培养融合形成紧密单层，模拟体内血脑屏障结构。如需后续荧光示踪检测，可提前用CellTracker橙色CMTMR染料（激发541/发射565 nm）标记细胞。
7. 隔天换液培养，持续培养约4天，直至细胞100%融合，之后检测紧密连接形成情况、屏障通透性，验证BBB模型是否搭建成功。
三、实操细节避坑（重点！解决渗漏核心要点）
✅ 吸取孔内液体时，枪头不要触碰半透膜，防止膜损伤直接造成渗漏；
✅ 不要低密度培养，尽量保证融合率长期维持在50%以上，避免细胞表型丢失；
✅ 换液操作动作轻柔，防止细胞漂浮、单层破损；
✅ 永生化细胞持续培养，培养基内需要一直添加Blasticidin S（终浓度4μg/mL），保证永生化基因稳定表达。
四、写在最后
体外BBB模型是药物脑靶向递送、神经毒性、脑内转运机制研究的基础模型，细胞状态、包被质量、换液节奏，都会直接决定模型成败。选用匹配的内皮细胞、周细胞与专用培养基，按照标准化流程操作，可以大幅降低渗漏失败率，稳定产出可重复的BBB模型。
一、实验材料选型
实验细胞
1. HBMEC 人脑微血管内皮细胞（货号：CD5177）
血脑屏障的核心组成细胞，负责阻挡可溶性物质、细胞从血液循环进入脑组织，表达特异性粘附分子，是构建屏障单层的主力细胞，具备脑血管内皮的组织特异性。
2. HPBC 人脑血管周细胞（货号：CD5022）
取自成人正常脑组织，经α-SMA免疫荧光鉴定；周细胞是维持微血管稳定、调控血管形成的关键细胞，搭配内皮细胞共培养，能显著提升BBB模型的屏障紧密性。P3代使用，配套专用培养基可实现10倍扩增。
细胞永生化小提示：原代细胞传代次数有限，可采用hTERT进行永生化改造，改造后细胞可稳定传40代以上，37℃常规培养即可；SV40改造成本更低，但大多需要33℃低温增殖。永生化细胞培养全程需添加终浓度4μg/mL的Blasticidin S HCI筛选，持续维持永生化性状。
配套培养基
1. ECGM内皮细胞培养基（货号：P1001）
低血清完全培养基，经过多部位人源内皮细胞验证优化；无支原体、无内毒素，添加肝素、内皮生长因子、胰岛素、抗氧化剂、皮质醇等组分，适配原代内皮以及永生化内皮细胞株。
2. PGM周细胞培养基（货号：P4001）
专门针对脑血管周细胞设计，规避周细胞和血管平滑肌细胞、成纤维细胞混淆的痛点；配方添加MB、B27、N2等生长因子，维持周细胞表型稳定，满足长期培养需求。
3. AGM星形胶质细胞培养基（货号：P2701）
适配原代星形胶质细胞体外培养，血清含量2%，含TGF、PDGF等生长因子，搭配抑制杂细胞增殖的添加物，适合星形胶质细胞培养，可用于更复杂的三细胞BBB共培养体系。
二、Transwell BBB模型详细操作步骤
1. 提前准备24孔Transwell培养板、ECGM培养基、包被液，所有试剂提前室温预热。
2. 超净台内拆开培养板，取200μL包被液（或稀释胶原酶）对小室半透膜进行包被处理。
3. 包被完成后吸出包被液，每孔加入200μL ECGM培养基，放入细胞培养箱预热备用。
4. 细胞消化收集（以T75瓶举例）：取出培养瓶，DPBS清洗；加入4 mL 0.05%胰蛋白酶，37℃消化3–5 min，镜下观察细胞变圆透亮、轻拍瓶壁脱落，立刻加入含血清完全培养基终止消化，1000 rpm离心5 min收集细胞沉淀。
5. 台盼蓝染色计数：取细胞悬液和台盼蓝1:1混匀，加至计数板，统计活细胞密度。
6. 细胞接种：HBMEC和HPBC按照1:1比例混合，调整细胞密度至1.6×10⁵个/mL，每小室接种500 μL细胞悬液。
分区说明：Transwell上室=血液侧，下室=脑侧；两种细胞共培养融合形成紧密单层，模拟体内血脑屏障结构。如需后续荧光示踪检测，可提前用CellTracker橙色CMTMR染料（激发541/发射565 nm）标记细胞。
7. 隔天换液培养，持续培养约4天，直至细胞100%融合，之后检测紧密连接形成情况、屏障通透性，验证BBB模型是否搭建成功。
三、实操细节避坑（重点！解决渗漏核心要点）
✅ 吸取孔内液体时，枪头不要触碰半透膜，防止膜损伤直接造成渗漏；
✅ 不要低密度培养，尽量保证融合率长期维持在50%以上，避免细胞表型丢失；
✅ 换液操作动作轻柔，防止细胞漂浮、单层破损；
✅ 永生化细胞持续培养，培养基内需要一直添加Blasticidin S（终浓度4μg/mL），保证永生化基因稳定表达。
四、写在最后
体外BBB模型是药物脑靶向递送、神经毒性、脑内转运机制研究的基础模型，细胞状态、包被质量、换液节奏，都会直接决定模型成败。选用匹配的内皮细胞、周细胞与专用培养基，按照标准化流程操作，可以大幅降低渗漏失败率，稳定产出可重复的BBB模型。
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