Vero是1962年由Yasumura和Kawakita从正常成年非洲绿猴肾组织建立的细胞系，为自发永生化的异倍体细胞，呈上皮样贴壁生长。该细胞不分泌干扰素α/β但具有干扰素受体，对多种病毒高度敏感，恶性转化程度低、遗传性状稳定、增殖速度快，是疫苗生产（狂犬病、乙脑、流感等）、病毒分离扩增、毒素检测（Vero毒素）的经典宿主细胞，也是病毒相关实验室最常用的工具细胞之一。Vero总体易培养，但贴壁较松，过度消化或机械扰动易脱壁、成团，对传代密度与血清质量较敏感，本文将针对Vero的细胞培养流程进行梳理和指导。
一、细胞复苏
1.【准备工作】配制完全培养基：MEM改良Eagle培养基（abs9467-500ml/SV30308.01）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010），取9mL完全培养基于37℃预热。水浴锅预热至37℃；生物安全柜紫外照射30min。
2.【融化】从液氮/冰箱取出冻存管，37℃水浴快速摇晃融化，约1-2min。
3.【重悬】75%酒精擦拭冻存管外壁，安全柜内开盖，将细胞悬液沿管壁缓慢滴入含9mL预热完全培养基的离心管中，避免直接冲击，轻柔混匀。
4.【离心】300×g离心5min，弃上清，去除DMSO残留。
5.【重悬】加入1-2mL完全培养基轻轻吹打重悬；接种T25培养瓶（加入4-6mL完全培养基），十字混匀，标注名称、代次、日期。
6.【培养】放入37℃、5%CO₂培养箱静置培养；Vero贴壁相对较慢，复苏后24-48h换液，去除死细胞碎片。
二、细胞传代
1.【实验准备】配制完全培养基：MEM改良Eagle培养基（abs9467-500ml/SV30308.01）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010）。提前取出PBS（abs962-500ml/SV30305.01）、完全培养基、0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01），恢复至室温；生物安全柜提前使用紫外照射30min。
注意：ATCC推荐的培养方案为Eagle's MEM（含非必需氨基酸NEAA）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+5%CO₂；若使用不含NEAA的培养基，建议补加非必需氨基酸，维持细胞状态稳定。
2.【镜检】融合度达80%-90%、细胞铺展饱满透亮即可传代；过度融合细胞单层易脱落、老化及表型漂移。
3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，沿瓶壁缓慢加入2-3mL PBS（abs962-500ml/SV30305.01），轻摇覆盖，吸弃。
4.【细胞消化】加入0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01）覆盖瓶底，37℃消化2-5min，镜下见细胞变圆、间隙增大即加等量完全培养基终止。
5.【离心】300×g离心5min，弃上清；加入完全培养基轻轻吹打10-15次重悬。
注意：Vero贴壁较松，吹打需全程轻柔，切勿暴力吹打使细胞层成片脱壁，导致细胞成团与损伤。
6.【传代】按1:3-1:6接种至新瓶（Vero增殖快，可根据密度与实验安排灵活调整），补加完全培养基至工作体积，十字混匀，标注信息。
7.【镜检】镜下确认分散均匀，放入37℃、5%CO₂培养箱，24-48h观察细胞状态。
注意：Vero增殖快（倍增时间约22-24h），通常2-3天传代一次，每周换液2-3次；高代次（＞150代）后生长状态明显下降，建议尽早冻存种子细胞，常规实验使用低代次细胞。
三、细胞冻存
1.【准备工作】冻存液：无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）或90% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+10% DMSO（abs9187-100mL）；冻存管标注名称、代次、冻存人、日期；安全柜紫外照射30min。
2.【细胞收集】融合度80%-90%时按传代步骤消化收集，300×g离心后弃上清。
3.【细胞重悬】加入冻存液（约1mL/管）轻柔吹打重悬，细胞密度约1-5×10⁶/mL。
4.【冻存】每管1mL入冻存盒，-80℃过夜后转移至液氮罐长期保存；建议冻存低代次（≤30代）细胞留种，维持细胞特性稳定。
四、关键注意事项
1.严格控制传代密度
不可使Vero细胞生长过密至完全汇合，过度长满会出现大面积空泡、细胞老化脱落、细胞密度达到80%即可传代，每周至少传代2-3次。
2.血清及培养基选择
（1）该细胞使用标准级或优级血清培养，对血清要求不高；
（2）首选MEM(含NEAA)，生长快、形态好、倍增约24h；适合日常传代，次选DMEM高糖营养更足，增殖更快；但长期培养易老化、空泡化。
3.污染控制
易支原体感染，表现为长势慢、形态变差、莫名漂浮；定期支原体检测，操作全程无菌。
参考资料
ATCC