ICR-MEF（ICR小鼠胚胎成纤维细胞）分离自ICR品系胎鼠（E12.5-E14.5），呈梭形、贴壁生长，是小鼠ESC、iPSC及多种难培养细胞的常用饲养层细胞。该细胞接受亚致死剂量γ辐照后，DNA发生双链断裂、丧失增殖能力，但保留正常代谢与分泌功能，可持续为上层干细胞提供胞外基质支撑和旁分泌因子，维持干细胞培养微环境，同时避免饲养层自身增殖争夺培养空间与营养。不同于常规扩增型细胞系，灭活后饲养层的培养与质控核心不在于传代扩增，而在于辐照剂量、铺板密度、贴壁时长以及有效使用窗口期的管控；任一环节出现偏差，都可能直接降低干细胞克隆形成率、影响多能性维持。本文将围绕γ辐照灭活型ICR-MEF梳理其培养流程。
一、饲养层细胞的复苏与铺板
1.【准备工作】配制完全培养基：DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）+10%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010），37℃预热。明胶包被液：0.1%明胶溶液（abs90048-500mL）；生物安全柜紫外照射30min。
2.【培养皿包被】在培养皿/板孔内加入足量0.1%明胶溶液覆盖底面，37℃静置30min，或室温静置2h；吸弃多余明胶，无需洗涤，直接晾干即可使用。明胶层干燥后不宜放置过久，建议当日包被当日用。
注意：未经明胶包被的培养板，饲养层细胞贴壁率显著下降，表现为细胞聚团、铺展不良，进而影响上层干细胞的接种均匀度。
3.【融化】从液氮取出冻存管，37℃水浴轻柔摇晃融化，约2min；融化期间保持管盖与O型圈在水面之上，减少污染风险。
4.【重悬】融化后立即取出，70%乙醇擦拭或浸洗消毒外壁，此后全程严格无菌操作；将细胞悬液转入含9mL完全培养基的离心管中。
5.【离心】约200×g离心5min（国内常规可用1000rpm离心4-5min），弃上清，去除DMSO残留。
6.【重悬与计数】加入1-2mL完全培养基轻轻吹打重悬，计数并调整密度；按1×10⁴-5×10⁴个/cm²接种至已包被的培养器皿（以6孔板为例约1×10⁵-3×10⁵个/孔）。
7.【培养】放入37℃、5%CO₂培养箱静置培养；贴壁至少2-4h，建议过夜，待细胞完全铺展、形态舒展后再接种目标细胞。
注意：饲养层铺板密度过稀，细胞会因缺乏接触而提前衰老变大、变扁平，失去支持能力；宁可略密，不可过稀。
二、饲养层细胞的验收与使用
1.【镜检形态】合格饲养层应为细长梭形、生长致密、折光性好；若细胞体积增大、扁平铺展、胞质颗粒增多，即为衰老表现，不可用于铺板。
2.【增殖验证】取同批细胞按相同密度接种一块平行样本，置于同一培养箱连续观察3天；若细胞密度无明显增加、计数基本持平，判定辐照合格；若仍持续增殖，说明照射剂量不足，须整批弃用。
3.【换液】接种目标细胞前吸弃旧培养基，用D-PBS（abs971-500ml/SH30028.02）
轻轻润洗1-2次，去除残留血清与代谢产物，再加入含目标细胞的完全培养基。
4.【共培养】将目标细胞（如mES/iPSC）按实验设计密度接种于饲养层之上，十字混匀后静置，24h内尽量少移动，以利克隆形成。
5.【维护】每1-2天换液一次；饲养层细胞在照射后2-3天开始死亡，须持续补充新鲜饲养层与培养基，不可依赖单次铺板长期维持。
注意：经射线处理的饲养层细胞已丧失增殖能力，不可再传代扩增；用多少复苏多少，剩余细胞按冻存流程处理或直接废弃。
三、饲养层细胞的冻存
1.【准备工作】冻存液：完全培养基+5%（v/v）DMSO（abs9187-100mL）；如使用无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）可省去程序降温步骤；冻存管标注名称、代次、是否已辐照、冻存人、日期；安全柜紫外照射30min。
2.【细胞收集】取对数生长期、汇合度80%-90%的细胞（辐照后或未辐照均可），吸弃旧培养基，D-PBS（abs971-500ml/SH30028.02）润洗1次后加入2-3mL 0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01），室温或37℃静置2-3min，镜下见细胞回缩变圆即可，加入完全培养基终止消化，轻轻吹打收集，离心后弃上清。
3.【细胞重悬】加入冻存液（约1mL/管）轻柔吹打重悬，细胞密度约1-5×10⁶/mL。
4.【冻存】每管1mL入冻存盒，-80℃过夜后转移至液氮气相长期保存；-80℃可存放数月，液氮可存放数年。
注意：饲养层细胞尽量现辐照现用；若必须冻存，应在辐照后尽早冻存并避免反复冻融，冻融本身会额外损伤细胞活力。
四、关键注意事项
1.培养基与血清
（1）标准配方为DMEM高糖+10% FBS，是保种与常规维持的首选；
A. （2）部分方案在DMEM基础上补加1% NEAA（SH30238.01）、2mM谷氨酰胺（abs9354-100ml）或0.1mM β-巯基乙醇（abs9592-100ml），以改善饲养层分泌功能，可按实验室既有习惯选择；
（3）饲养层细胞对血清批次较为敏感，建议固定批号并使用优级胎牛血清（abs972-500mL/SV30302.03），更换批次前先做小规模平行验证。
2.辐照剂量与灭活方式
（1）γ射线标准剂量为30 Gy（3000 rad），国内多数实验室对P3-P5代细胞采用此剂量；原代细胞对辐射相对耐受，剂量不宜低于30 Gy；
（2）传至第3-5代的细胞活力更旺盛，部分方案将剂量下调至20 Gy即可实现完全灭活；文献中亦有20-30 Gy、30-50 Gy等区间报道；
（3）无论采用何种剂量，均须以连续培养3天无明显增殖作为放行标准，不可仅凭剂量数值判断；
（4）若无辐照条件，可用丝裂霉素C替代：10μg/mL处理2.5-3h（或2-4μg/mL处理2h），随后用D-PBS（abs971-500ml/SH30028.02）充分洗涤4-5次，残留未洗净会毒害上层干细胞。
3.铺板密度与贴壁
（1）推荐接种密度1×10⁴-5×10⁴个/cm²（约3×10⁴个/cm²亦可），以铺满底面、细胞彼此接触但不重叠为宜；
（2）密度过低是饲养层提前衰老最常见的原因，宁可略密不可过稀；
（3）铺板后至少静置2-4h，建议过夜再接种目标细胞，以保证饲养层形成完整单层；
（4）必须使用明胶（0.1%）或等效基质包被，未包被的培养器皿贴壁率明显下降。
4.使用窗口与维护
（1）辐照后3-4天内用完为最佳，一般不超过5天；
（2）失活饲养层细胞在接种后2-3天开始死亡，需定时补充新鲜饲养层与培养基，不可一次性铺板长期使用；
（3）丝裂霉素C处理的饲养层可维持8-12天不增殖，但建议6天内使用；
（4）换液时动作轻柔，饲养层细胞贴壁虽牢但已无修复能力，机械损伤不可逆。
5.形态与质控判断
（1）正常：细长梭形、排列致密、折光性好、胞质清亮；
（2）异常：细胞变大、扁平、胞质颗粒增多或出现空泡——提示衰老或辐照剂量过大，不宜使用；
（3）异常：细胞成团不铺展——多为未包被、消化过度或离心力过大所致；
（4）建议定期支原体检测；饲养层与干细胞共培养体系中，隐性污染更难察觉。
6.与目标细胞的配合
（1）饲养层细胞与目标细胞种属须匹配（ICR MEF用于小鼠ESC/iPSC），跨种属使用需另行验证支持效果；
（2）饲养层细胞本身不参与实验分组，但会分泌因子干扰检测，涉及分泌蛋白、代谢组或转录组分析时，应设置仅饲养层对照孔；
（3）一管饲养层细胞（约1×10⁶个）通常可铺满85 cm²面积，可按实验规模反推复苏管数。