【Open Biology】The Aurora B-controlled PP1/RepoMan complex determines the spatial and temporal distribution of mitotic H2B S6 phosphorylation
利用链霉亲和素多重免疫荧光微球筛选 H2B S6 磷酸化位点特异性单克隆抗体

有丝分裂过程中，组蛋白磷酸化的精准时空调控，是保证染色体浓缩、纺锤体组装和姐妹染色单体分离等过程正常进行的关键。该调控一旦紊乱，会导致染色体不稳定；而染色体不稳定正是诸多肿瘤细胞的典型特征。已有研究表明，组蛋白 H2B 第 6 位丝氨酸磷酸化（H2B S6ph）特异性富集于内着丝粒区域，在细胞分裂中期达到峰值，对染色体分离至关重要。目前，调控该修饰的定位、强度与时序的分子机制尚不明确。

本文利用 PolyAn Red4 Multiplex Beads 链霉亲和素多重免疫荧光微球，对杂交瘤培养上清中的候选抗体进行筛选，制备了高特异性 H2B S6ph 单克隆抗体，识别磷酸化 H2B S6 肽段、不结合未修饰肽段，且不受邻近氨基酸修饰的干扰，为深入机制解析提供了可靠的实验工具。

作者单位：德国吉森大学、亥姆霍兹慕尼黑中心等

期刊：Open Biology

发表年份：2024 年

研究对象：H2B S6 磷酸化位点特异性单克隆抗体

PolyAn 材料：PolyAn Red4 Multiplex Beads（链霉亲和素多重免疫荧光微球）

PolyAn Red4 Multiplex Beads 链霉亲和素多重免疫荧光微球，分别偶联生物素化 H2B 磷酸化肽段（S6 磷酸化抗原）以及未磷酸化对照肽，再与杂交瘤培养上清共同孵育，使杂交瘤细胞分泌至上清的抗体与微球表面的对应肽段特异性结合。通过流式细胞仪采集微球的荧光信号，区分特异性识别磷酸肽的阳性克隆与结合非磷酸肽的非特异性克隆，快速筛选出仅靶向 H2B S6 磷酸化位点、不结合未修饰 H2B 肽的杂交瘤细胞株。

基于 PolyAn Red4 Multiplex Beads 链霉亲和素多重免疫荧光微球筛选，获得 1D4 特异性抗体。Western blot 验证确认，1D4 可灵敏检测 H2B S6ph 修饰。Western blot 结果显示，CDK1/Cyclin B1 可介导 H2B S6 位点磷酸化，分别引入 PP1 的不同亚型，以检测去磷酸化活性。在总 H2B 底物、CDK1 激酶量统一的条件下，PP1‑α 可显著降低 H2B S6ph 信号；PP1‑β 几乎无法催化该位点去磷酸化；PP1‑γ 仅表现出部分去磷酸化活性。上述结果说明， PP1 不同亚型对 H2B S6 磷酸化位点的催化能力存在亚型偏好，PP1‑α 是介导 H2B S6ph 去磷酸化的主要亚型。

图 1：PolyAn 微球筛选 1D4 抗体的 Western blot 验证结果。1D4 能够检测 H2B S6ph，验证前期微球筛选获得了可用于该磷酸化位点检测的抗体。

本研究阐明了有丝分裂过程中 H2B S6 磷酸化的逆转机制，明确了 PP1‑α 是负责移除 H2B S6 磷酸修饰的主要磷酸酶，完善了 “Aurora B‑PP1‑Mklp2” 通路对组蛋白修饰的时空调控机制，解释了内着丝粒区域 H2B S6ph 在分裂中期出现、后期消失的分子原理。

原文链接：https://doi.org/10.1098/rsob.230460

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