利用安捷伦SampliQ SCX 固相萃取柱和液相色谱/串联质谱联用检测猪肉中的β2-激动剂

应用报告/食品安全

作者: Chenhao Zhai 安捷伦科技有限公司
中国上海外高桥保税区，英伦路412 号 上海，200131 中国

Jianzhong Li and Yue Song 安捷伦科技有限公司
福州路318 号, 高腾大厦11 楼 上海200001 中国

摘要
本应用报告开发并验证了一种同时检测四种β2-激动剂残留物的方法，包括特布他林、 沙丁胺醇、克仑特罗和福莫特罗。分析物经过液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)纯化后， 由正离子多反应监测模式下的液相色谱耦合电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS/MS)进行定量。

该方法为检测猪肉中四种β2-激动剂提供了亚ng/g 水平的检测限（LOD），以及0.25 至5 ng/g 的动态校准范围。总回收率为78%至101%, 相对标准偏差(RSD)为1.8%至7.2%。

前言
β2-激动剂是广泛应用于猪肉生产中的一种非法生长促进剂。最近发生的中毒事件都是因为猪肉中含有高水平的β-激动剂（克仑特罗）。本应用报告采用了安捷伦公司新推出的固相萃取（SPE）产品来提取和浓缩猪肉中的β-激动剂，并采用LC-MS/MS 进行分析。表1 给出了四种β-激动剂化合物的名称和结构。

表1. 本研究中采用的β2-激动剂化合物

实验
试剂及药品
所有试剂都是质谱纯级、高效液相纯级或分析纯级。

乙腈和水由Scharlau 公司提供。乙酸乙酯、异丙醇由Fisher 公司提供。标准物均采购自国家药品生物制品检定所（NICPBP）。 猪肉则由本地市场采购。 以甲醇配制单个标准溶液（1.0 mg/mL），并在4 °C 下冷藏。

以甲醇-水(10:90) 配制合并工作溶液（10 μg/mL），并在4 °C 下冷藏。添加溶液应每周配制, 以适当稀释合并工作溶液来制备。

设备与材料
安捷伦1200 高效液相色谱系统
安捷伦6460 三重四极杆液相色谱-质谱/质谱联用系统
安捷伦SamliQ SCX 聚合物柱，50×3 mL 管，60 mg（部件号：5982-3236）
安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱，50 × 2.1 mm, 1.8 μm (部件号: 959741-906)
安捷伦真空歧管处理盒(部件号: 5982-9120)

样品制备
液-液提取
于15mL 带盖聚丙烯管中称取2 g 猪肉（精确至±0.01 g）。加入 8 mL 0.2M 的乙酸钠（pH 值5.2）溶液，并涡旋以混合均匀。然后加入100 μL β-葡萄糖醛酸酶（1000 U/mL）并涡旋混合2 分钟。样品在37 °C 下水解16 小时。

水解产物经震动处理15 分钟后，在离心机中用4000rpm 的速度离心分离10 分钟。取4 mL 上层清液至另一离心管中，加入5 mL
0.1M 高氯酸溶液并调节pH 值至1 ± 0.3，再在离心机中以 4000 rpm 的速度离心分离10 分钟。将上层清液移至另一试管中，用10M 氢氧化钠溶液调节其pH 值至11。

于样品试管中分别添加10 mL 饱和氯化钠溶液和异丙醇-乙酸乙酯（60:40）混合液，并震动处理5 分钟。以4000 rpm 离心分离5 分钟后, 将有机层仔细转移至另一离心管中。将异丙醇-乙酸乙酯混合液的添加、震动处理、离心分离和转移有机液层的过程重复两次，并将所有上清液合并。

样品于40 °C 以氮气吹干，并将残留物复溶于5 mL 0.2M 的乙酸钠（pH 值5.2）溶液中。该样品将用于固相萃取纯化。

固相萃取
固相萃取过程（SPE）如图1 中所示。先用3 mL 甲醇活化安捷伦SampliQ SCX 柱，然后用3 mL 水平衡。取5 毫升样品溶液载入到柱中，并以重力通过色谱柱（约1 mL/min）。用2 mL 水和2 mL

2%甲酸水溶液冲洗SPE 小柱，丢弃所有洗脱液。真空抽干SPE 小柱。最后以5 mL 5%氨甲醇溶液洗脱，流速约为1 mL/min。洗脱液于40 °C 氮气吹干，残留物复溶于1 mL 0.1%甲酸的水/乙腈 （90:10）溶液。样品经涡旋混合和超声波处理以完全溶解后转移 至1.5 mL 离心管中，并在3000 rpm 条件下处理5 分钟。最后将样品转移至2 mL 的色谱小瓶中等待分析。

图1. 猪肉的清理和浓缩-固相萃取过程

仪器条件
高效液相色谱条件
色谱柱: 安捷伦ZORBAX Eclipse Plus C18 色谱柱，
50 × 2.1 mm, 1.8 μm (部件号: 959741-906)
流速: 0.4 mL/min
柱温: 40 °C
进样体积: 5 μL
流动相: 水（0.1%甲酸溶液+2mM乙酸铵，A），
乙腈（0.1%甲酸, B）

梯度淋洗:

质谱条件
在正极模式下对4 种化合物进行了监测。离子源条件如图2 所示，多反应监测通道如表2 中所示。

图2. 四种化合物的质谱源参数

表2. 多反应监测模式的质量监测

结果与讨论
线性与检测限
标准工作曲线（0.25，0.5，1.0，2.0 和5.0 ng/g）是以添加适量混合工作溶液于空白基质来配制的。空白基体是通过将猪肉进行水解、液液萃取和固相萃取来制备的。校准曲线的结果如表3 中所示。检测限(LOD)定义为每个化合物给出信噪比(S/N)大于3:1 的时浓度。各化合物的检测限也列于表3 中。

表3. β2-激动剂的线性和检测限

回收率和重现性
在猪肉中分别添加标样浓度为0.5, 1.0, 2.0 ng/g, 计算回收率和重现性。每个浓度重复分析6 次。回收率和重现性数据列于表4 中。 添加猪肉萃取物（1.0 ng/g）的色谱图如图3 中所示。

表4. 采用安捷伦SampliQ SCX 进行固相萃取猪肉中β2-激动剂的回收率和重现性；(部件号: 5982-3236)， 平均回收率90%，平均相对标准偏差4.4%

图3. 1.0 ng/g 添加猪肉样品萃取物的色谱图

结论
本研究表明，安捷伦SampliQ SCX 可以作为在复杂基体中（如猪肉）进行多种β2-激动剂的纯化和浓缩的有效方法。用标准添加基质所测定的回收率和重现性, 符合猪肉中β2-激动剂残留物检测的中国国家标准。杂质以及基质效应是不会干扰任何目标化合物的定量，最低定量限明显低于最高残留限量[1,2]。

参考文献
1. GB/T 21313-2007“动物源性食品中β2-激动剂的高效液相色谱串联质谱法分析”
2. SN/T 1924-2007“进出口动物源性食品中的克仑特罗、雷托巴胺、沙丁胺醇和特布他林残留物的高效液相色谱-质谱/质谱联用法测定”

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