RT-PCR中引物的选择指南

2013-03-24 来源:本站点击次数:1761

一.用于RT-PCR的引物
    1.特异性引物（跨内含子设计引物）
    2.随机引物（Random primer）
   3. oligo(dT)引物
二.反转录酶M-MULV和AMV
三.常用内参引物的参考序列

一般做RT-PCR进行第一链cDNA合成的起始可以使用特异性引物、随机引物（Random primer）、oligo(dT)三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量、种类及效果（如表一）。

1.特异性引物（跨内含子设计引物）

对于RT-PCR，引物设计质量影响RT的结果，而且不同引物退火温度本来就不相同，所以第一链cDNA合成不推荐使用。但是如果以RNA为模板进行一步法检测基因表达情况，一般建议添加特异性引物，这样设计的主要目的是消除RT-PCR时基因组DNA污染对结果的影响。跨内含子设计引物有两种做法（如下图A和B）：

1.1在两个不同的外显子上设计引物，上下引物分别位于不同的外显子上

这样从和cDNA和基因组DNA中扩增的片段大小不同(基因组DNA中的包含内含子扩增的要大些)，从而可以通过用合适的延伸时间来限制基因组中大片段的扩增，消除基因组DNA污染的影响(这要求跨越的内含子要大些)。

1.2上游或者下游引物或者两者，引物本身在两个不同的外显子上

注意引物在两个外显子上分布，在“内侧”要少些，少于8bp左右。这样的引物就不能从基因组DNA扩增，从而消除基因组DNA污染的影响(这要求目的基因具有较多的外显子，从而有较多的选择，引物本身质量可能不好。

2.随机引物（Random primer）

在两步法RT-PCR中，mRNA必须先转录为cDNA。在这种情况下，采用不依赖序列的引物，例如随机引物和oligo(dT)引物。

随机引物，一般指的是多个任意的碱基连接而成的一套寡聚引物组，常见的是random（6），random（9），random（10），如果6个碱基的随机序列，则是5’-d（NNNNNN）-3’，共有4⁶条引物。

原核生物由于没有poly(A)，因此在进行总mRNA的RT时要用到随机引物，由于其比较短小，且随机组合丰富，所以在mRNA上的结合也很多，产生短的，部分长度的cDNA，因此也可以进行有效的RT。这种方法经常用于获取5’末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。因此一般适用于长的或具有发卡结构的RNA；适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有单一模板RNA的反转录反应。在RT-PCR用随机引物制备CDNA时，要去除总RNA中的tRNA 、rRNA，只保留mRNA。

因为体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，所以随机引物法是三种方法中特异性最低的，通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。所以随机引物介导制备的cDNA产物复杂程度高，从而降低了后续PCR反应的敏感度和特异性。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20μl反应体系。

2.1随机引物优先应用范围：

ü RT-PCR实验中，合成带有或不带有poly（A）的cDNA。

ü 长片断的mRNA5’—区域的RT –PCR。

ü 模板RNA具有较多二级结构的CDNA的合成。

ü 可用于Northern/Southern杂交、原位杂交和克隆／噬菌斑杂交的标记探针。mRNA差异显示。

ü 病毒鉴定，因为大多数病毒的序列是未知的，所以在RNA病毒的研究中一般用随机引物进行扩增并进行鉴定。

3. oligo(dT)引物：

Oligo(dT)一般指的是多个T碱基连接而成的寡聚引物，主要是针对真核生物具有Poly(A)尾时设计的用于RT，因此RT-PCR Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2％，因此之前必须先把poly(A)+RNA提取出来。所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20μl反应体系使用0.5μg oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。

3.1 oligo(dT)适应范围：

Oligo(dT)针对真核生物具有Poly(A)尾设计，所以特异性好，但是同时对RNA样品要求较高，是生成全长cDNA的大多数两步RT-PCR应用中较受欢迎的引物延伸法。原因是许

多逆转录酶不能高效地将全长mRNA序列转录到5’端。但是即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。因此对于较长的mRNA，或是因为RNA 中间可能具有的二级结构等往往使得反转录反应提前终止，也导致不能达到mRNA 的5’末端，就是扩增片段的长度有限，这一方面和RNA完整性和结构有关，另的限制在于反转录酶的延伸能力，用oligo dT primer扩增可能出现扩增出来的片段长度短，导致想要的那部分序列在一次扩增的时候，没有被扩增出来，虽然都有mRNA的3’端，但是序列信息多位于3’-UTR附近，有用信息很少，不利于序列的识别和分析，这个时候同时采用随机引物和Oligo(dT)启动反转录反应是一个更好的选择，从而获得目的基因的全长序列。在采用寡（dT）引物时，推荐选择3’端引物用于以后的PCR反应。

表一：三种引物应用特点

名称	特异性引物	Random 引物	oligo(dT)
序列	该类引物与模板序列特异性结合。	多个任意的碱基连接而成的一套寡聚引物组，常见的是random（6），random（9），random（10），	多个T碱基连接而成的寡聚引物， oligo(dT)10-18，
特点	模板必须是已知的，可以消除RT-PCR时基因组DNA污染对结果的影响。	比较短小，随机组合丰富，与模板结合位点多，在RT种是含有二级结构模板的最佳组合，但同时导致制备的cDNA产物复杂程度高，从而降低了后续PCR反应的敏感度和特异性。	针对Poly(A)尾巴设计，与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多，但同时，对于比较长的mRNA，他经常不能延伸到5’端。但对RNA样品要求较高，即使有少量降解也会是全长cDNA合成量大大减少。
适用实验	但是如果以RNA为模板进行一步法检测目标基因，一般建议添加特异性引物。一般第一链CDNA合成不推荐使用。	1.RT-PCR实验中，合成带有或不带有poly(A)的cDNA。2.长片断的mRNAS 5’的RT-PCR。3.模板RNA具有较多二级结构的CDNA的合成。4.可用于Northern/Southern杂交、原位杂交和克隆、噬菌斑杂交的标记探针。 5.mRNA差异显示。6.病毒鉴定，因为病毒序列大多数是未知的，在RNA病毒的研究中一般用随机引物进行扩增并进行鉴定。	适合于模板是Poly(A)+RNA的RT-PCR实验，如果目标序列位于基因的5’端，那么推荐采用随机六聚体引物或随机六聚体与寡(dT)n引物的混合物用于逆转录步骤。一般采用60μM随机六聚体和2.5μM寡(dT)n。
纯化方式	HAP, ULTRAPAGE, HPLC	HAP	HAP

二. 反转录酶M-MULV和AMV

通常M-MULV用于普通的RT反应，AMV用于基因比较复杂、有二级结构或GC含量较高的RT反应，如果cDNA要用于克隆表达，建议使用M-MULV或AMV。

反转录酶，又称逆转录酶，是依赖RNA为模板的DNA聚合酶的统称。美国科学家H.M.Temin和D.Baltimore在1970年发现了反转录酶，并因此获得了1975年的诺贝尔生理学医学奖。目前常用的反转酶主要有AMV（avian myeloblastosis virus）和M-MULV（molomey murine leukemia virus）两种反转录酶。AMV来源于禽成髓细胞瘤病毒，最适反应温度在42℃，具有较强的反转录活性和RNase-H活性， RNase H是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到DNA链上的RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链，从而限制了cDNA的合成长度。与之对应的M-MULV该酶基因来源于莫洛尼氏小鼠白血病病毒，在具有较强的反转录活性的同时，却具有较低的RNase-H活性，所以它可以获得较长的cDNA片段。目前通过基因工程的方法降低RNase-H活性，使得M-MULV的反转录活性大大提高，提高酶的热稳定性，因此目前M-MULV应用最广。

表二：RT-PCR中常见的反转录酶M-MULV、AMV的应用

名称	M-MULV	AMV
来源	莫洛尼氏小鼠白血病病毒（molomey murine leukemia virus）	禽成髓细胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus）
特点	DNA-RNA依赖的聚合酶活性。 RNase-H活性较低，有较强的反转录活性，42范围具有最佳活性。制备CDNA最长可9Kb。	DNA-RNA依赖的聚合酶活性。DNA-RNA解旋活性，RNase-H活性较强，有较强的反转录活性，最适45-50℃.在45-60℃很宽的范围具有活性。制备CDNA最长可13Kb。
修饰后	点突变后RNase-H活性完全消失，因此可以扩增长达13Kb的CDNA，42-45℃范围具有最佳活性。55℃仍有活性，因此可以适合具有大量二级结构的模板，提高反应的褪火温度。	可以扩增长达13Kb的CDNA，42-45℃范围具有最佳活性。55℃仍有活性，因此可以适合具有大量二级结构的模板，提高反应的褪火温度。
适用实验	RT-PCR反应中如果使用来做检测，价格比AMV稍便宜。	基因比较复杂、有二级结构或GC含量较高的RT反应，如果是用来扩增目的片段，可选用AMV。

三.常用内参引物的参考序列:

内参基因名称	引物名称	序列	引物位置	引物T m	最佳退火温度 ℃	扩增长度
基因库序列号	引物名称	序列	引物位置	引物T m	最佳退火温度 ℃	扩增长度
Human actin beta BC002409	F305	Ctgggacgacatggagaaaa	305-324	52.3	59.4	564
	R868	aaggaaggctggaagagtgc	868-849	52.6	59.4	564
	F1379	agcgagcatcccccaaagtt	1379-1398	57.3	54	285
	R1663	gggcacgaaggctcatcatt	1663-1644	56.3	54	285
Rat actin betaNM_031144	F18	cacccgcgagtacaaccttc	18-37	54.5	60.4	207
	R224	cccatacccaccatcacacc	224-205	54.4	60.4	207
	F694	gagagggaaatcgtgcgtgac	694-714	54	57.1	452
	R1146	catctgctggaaggtggaca	1146-1127	53.2	57.1	452
Mouse actin betaNM_007393	F91	atatcgctgcgctggtcgtc	91-110	57.5	60.4	517
	R607	aggatggcgtgagggagagc	607-588	57.8	60.4	517
	F1566	gtccctcaccctcccaaaag	1566-1585	54.5	55.7	266
	F1831	gctgcctcaacacctcaaccc	1831-1811	54.4	55.7	266
human GAPDHBC004109	F369	agaaggctggggctcatttg	369-388	55.6	57.5	258
	R626	aggggccatccacagtcttc	626-607	55.1	57.5	258
	F66	aggtcggagtcaacggatttg	66-86	52.5	57	532
	R597	gtgatggcatggactgtggt	597-578	52.6	57	532
Rat GAPDHBC059110	F50	cagtgccagcctcgtctcat	50-69	55	58.3	595
	R644	aggggccatccacagtcttc	644-625	55.1	58.3	595
	F1029	acagcaacagggtggtggac	1029-1048	54.4	57.7	252
	R1280	tttgagggtgcagcgaactt	1280-1261	54.8	57.7	252
Mouse GAPDHM32599	F306	aggccggtgctgagtatgtc	306-325	54	58.7	530
	R835	tgcctgcttcaccaccttct	835-816	54.6	58.7	530
	F49	ggtgaaggtcggtgtgaacg	49-68	55.1	56.8	233
	R281	ctcgctcctggaagatggtg	281-262	54.5	56.8	233
Rat 18S rRNAM11188	F1865	tgcggaaggatcattaacgga	1865-1886	58.6	59.3	300
Rat 18S rRNAM11188	R2164	agtaggagaggagcgagcgacc	2164-2143	59	59.3	300
human 18S rRNAM10098	F1565	cagccacccgagattgagca	1565-1584	58.3	59	253
human 18S rRNAM10098	R1816	tagtagcgacgggcggtgtg	1816-1797	58.3	59	253
mouse 18S rRNAK013364	F56	aggggagagcgggtaagaga	56-75	54.4	62	241
mouse 18S rRNAK013364	R296	ggacaggactaggcggaaca	296-277	54.4	62	241

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