编      号：31000
包      装：5×1mL
分 子 信 息：专利保护*
颜色和形式 ：橙色溶液
光 谱 特 性：λabs/λem = 500/530nm (DNA结合)
                    λabs = 471nm (无DNA结合)

储存和处置方法
通常情况下，EvaGreenTM 20×溶液在室温下稳定。在暗处室温下可以储存至少6个月，或者在4℃冰箱中储存至少一年。当染料从冰箱中取出时，应将溶液剧烈振荡几秒钟，以防止储存时管壁对染料的吸附。
产品描述
EvaGreenTM是绿色荧光核酸染料。它的诸多有点使它可以用于多种应用，包括：qPCR，高分辨率DNA熔解曲线（HRM）分析，常规的DNA定量以及毛细管电泳。当染料和DNA结合后，其激发和发射光谱与荧光素（FAM）以及SYBRTM Green I相似（图1）。这使得该染料可以直接用于配置了488nm氩离子激光器或者此光谱区域内任何可见光激发装置的仪器。EvaGreenTM有良好的热稳定性和水解稳定性（图2），为常规操作提供了便利。EvaGreenTM本身没有荧光，但和dsDNA结合后能发出高亮度的荧光，这种特性使它特别适合于实时定量PCR（qPCR）的应用。和广泛使用的SYBRTM Green I相比，EvaGreenTM对PCR的抑制更小，更不容易产生非特异性扩增。因此，和SYBRTM Green I相比EvaGreenTM可以在更高浓度下使用，从而产生更强的扩增信号。更重要的是，使用时的高浓度可以消除所谓的“染料重分布”问题。这一问题会影响使用SYBRTM Green I时PCR后的熔解曲线分析，使常规DNA熔解曲线分析不再可靠（Giglio, et al. Nucleic Acid Res. 31(22), e136(2003)），同时也不能应用于HRM（Wittwer, et al. Clin. Chem. 49(6), 853(2003)）。与之相反，EvaGreenTM既适合qPCR也适合HRM，并获得高信号高重复性的结果。
EvaGreenTM20×溶液专为qPCR设计。PCR反应过程可以用SYBR Green I或FAM通道在任何一台商业化的实时定量PCR仪上监测。下面提供的qPCR步骤适用于常规非热启动Taq聚合酶。当使用热启动Taq聚合酶时，需要对PCR缓冲液中离子强度和pH值进行调整以充分发挥EvaGreenTM的优点。例如，使用化学修饰的Taq聚合酶，如AmpliTaq Gold，可能需要降低KCl浓度同时升高Tris浓度。另外，水溶性溶剂，如DMSO或者甘油，常被用来作为添加剂以稳定master mix。这些组分以及pH值
对于50μL反应体系的推荐实验步骤
1  按下列条件配制反应体系：

加入Di-H2O使最终体积达到50μL
  在实时定量PCR仪上进行PCR反应，并在退火或延伸时记录荧光信号。
对于iCycler用户，PCR混合物中不需要添加FAM，因为EvaGreen微弱的背景荧光可以提供足够和稳定的基线荧光信号用于孔与孔之间的校正。
当使用ABI序列检测系统时，一定要在WELL INSPECTOR选项卡下的非反应性参照中选择“无”。
当使用Roche的LightCycler时，可能需要向反应体系里添加BSA。终浓度为0.5 mg/mL的BSA可能足够了。当使用SYBR Green时，额外添加的蛋白如BSA可以提高荧光，以提供背景信号触发LightCycler启动。而EvaGreen对蛋白不太敏感，您需要调整仪器设置（背景荧光信号）以启动仪器。
化学修饰的Taq聚合酶，可能需要降低KCl浓度同时升高Tris浓度
配合EvaGreenTM使用的最佳Mg2+离子浓度为2.5mM。
在吸取之前，使20×溶液恢复到室温并剧烈振荡使其混匀。虽然EvaGreenTM非常稳定，但染料在低温下长时间储存时可能会被管壁吸附。如果此类的情况，将整管染料剧烈震荡几秒钟即可解决问题。
为了获得最理想的结果，请使用热启动Taq聚合酶。
使用实时定量PCR可能需要Roche或Applied Biosystems公司授权。
毒性
独立实验室（Litron Laboratories, Rochester, NY）进行的艾姆斯氏测试结果表明，EvaGreenTM没有诱变性和细胞毒性。实验显示，EvaGreenTM完全没有细胞膜透性（图3），这可能观察到低毒性的关键因素。与之相反，SYBRTM Green I被认为具有高效的诱变增强特性，很可能抑制了细胞内正常DNA的修复机制（Ohta et al. Mutation Research 492, 91(2001)）。SYBRTM Green I的毒性可能和它快速进入细胞的能力相关（图3）。
由于这些测试都不是人体实验，我们仍然建议研究人员在接触染料或其他和DNA结合的分子时做好防范措施，佩戴乳胶手套。从Biotium网站下载完整报告以了解更多关于艾姆斯氏测试结果。

处理方法
EvaGreenTM溶液可以使用下列任意一种方法处理：1）在一加仑（约4L）含有染料的废液中加入25－50mL漂白剂（常规家用漂白剂），充分反应8小时以上再倒入下水道；2）将每10升EvaGreenTM废液通过约1g活性碳过滤。滤液可以直接排入下水道，而活性碳则可以作为常规固体废物处理。
图2.分别将1.2μM SYBRTM Green I和EvaGreenTM配制在pH9的Tris缓冲溶液中并在99℃孵育。每三小时记录一次两种溶液的吸收光谱。加入ROX作为稳定性参照。
图3.在37℃下分别用SYBRTM Green I（1.2μM）和EvaGreenTM（1.2μM）孵育Hela细胞。在孵育5min（图A）和30min（图B）后分别成像。SYBRTM Green I能快速进入细胞，而EvaGreenTM则完全没有细胞膜透性。