靶向序列捕获和新一代测序前对石蜡包埋组织及新鲜冷冻组织进行DNA质控
2019-06-21 来源:本站 点击次数:7513
靶向序列捕获和新一代测序前对福尔马林固定石蜡包埋组织及新鲜冷冻组织进行 DNA 质量控制
作者
Melissa Huang Liu
安捷伦科技有限公司
美国加利福尼亚州拉霍亚
Maria Celeste Ramirez
安捷伦科技有限公司
美国加利福尼亚州圣克拉拉
摘要
本文将介绍利用 Agilent 2100 生物分析仪系统的微控流芯片电泳，在新一代测序工作流程的 SureSelect 靶向序列捕获之前或期间，对福尔马林固定石蜡包埋组织及新鲜冷冻组织的 DNA 样品进行质量控制。借助 2100 生物分析仪系统可靠的 DNA 电泳技术，可提供弥散条带谱及详细的文库统计信息，例如峰高、平均弥散条带分子量、分子量分布和 DNA 浓度。FFPE DNA 样品的结果与新鲜冷冻组织和对照 DNA 的 DNA 分析结果具有可比性。
前言
最常用的临床样品保存和存档方法之一 是制备福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织。全世界的组织库、医院及实验室内存档的 FFPE 组织样本数超过 4 亿个。组织样本通过解剖或活检进行收集，然后用福 尔马林固定以及石蜡包埋以保持其完整性， 用于组织病理学研究及显微镜观察。收集到的这些病变组织和正常组织未来可能会成为分子遗传学研究中非常有价值的资源。但是，从 FFPE 样品中进行 DNA 提取面临巨大的挑战[1]。甲醛交联、降解以及单链和双链 DNA 相混合等常见问题会导致适合下游应用的 DNA 材料数量减少。因此，对用于新一代测序 (NGS) 等高灵敏度、成本高昂的应用的样品进行质量评估显得 尤为重要。
经验证，2100 生物分析仪是 NGS 工作流程中进行片段 DNA 和 DNA 文库分子量测定以及定量分析的一个重要工具[2]。本文将介绍利用 2100 生物分析仪的芯片电泳技术对 NGS 靶向序列捕获工作流程中的
FFPE 和新鲜冷冻 DNA 样品进行分析。
实验部分
材料
FFPE 及新鲜冷冻组织的 DNA 由西奈山医学院捐赠（美国纽约州纽约市）， NA10831-1 对照 DNA 购自科里尔研究所（美国新泽西州卡姆登）。QIAmp DNA FFPE 组织试剂盒购自 QIAGEN GmbH（德国希尔登）。Ambion RecoverAll 总核酸分离试剂盒购自 Life Technologies 公司（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。E220样品前处理系统购自 Covaris 公司（美国马萨诸塞州沃本）。2100 生物分析仪、安捷伦 DNA 1000 试剂盒，以及安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒均来自安捷伦科技有限公司（德国瓦尔特布隆）。
样品前处理
采用 QIAGEN FFPE 组织试剂盒及 Ambion 核酸分离试剂盒提取病人 FFPE 肿瘤组织中的基因组 DNA。所有样品均采用 SureSelect 靶向序列捕获实验方案进行进一步处理[3]。
采用芯片电泳进行 DNA 质量控制
DNA 电泳采用了 2100 生物分析仪，并根据生产商的实验方案[4,5]，联用 DNA 1000 试剂盒或高灵敏度 DNA 试剂盒。并在区域 (Region) 表格中对弥散条带的浓度及平均分子量进行分析。峰高在色谱峰 (Peak) 表格中进行测定，如 SureSelect 实验方案中所述[3]。
结果和讨论
要想成功实现靶向序列捕获和 NGS，关键是在样品前处理工作流程中的特定时间点对样品质量进行评估。在本文中，源自病人 FFPE 组织的基因组 DNA (gDNA)、新鲜冷冻肿瘤组织中相匹配的 gDNA，以及对照细胞系 DNA 均根据 SureSelect 实验方案进行处理。利用 2100 生物分析仪在一些关键步骤进行 DNA 样品质量控制(QC)：剪切后片段化、捕获前扩增及捕获后扩增（图 1）。
剪切后片段化分析
源自 FFPE 样品的 DNA 采用两种不同的方法进行提取 — QIAGEN FFPE 组织试剂盒 (FFPE DNA Q) 和 Ambion 核酸分离试剂盒(FFPE DNA A)，并与相匹配的新鲜冷冻组织提取的 DNA 及对照 DNA 进行比较。所有样品均采用 Covaris 系统进行片段化。剪切后样品采用 DNA 1000 试剂盒分析(图2），结果显示各样品均出现 100 至 450 碱基的弥散条带。除了分子量及纯度信息外，100 生物分析仪还可提供每个样品的总 DNA 浓度，并对特定区域内的弥散条带定量。
图2. 剪切后的片段分布。使用 Agilent 2100 生物分析仪及安捷伦 DNA 1000 试剂盒分析样品所得的胶图及电泳叠加谱图。样品：FFPE DNA Q（红色），FFPE DNA A（蓝色），新鲜冷冻组织
DNA（绿色），对照 DNA（浅绿色）
捕获前扩增
四个 DNA 样品按照样品前处理工作流程（图 1）进行进一步处理。对捕获前扩增样品进行五次 PCR 循环，然后采用 DNA 1000 试剂盒在 2100 生物分析仪上进行分析（图 3）。
图3. 使用 Agilent 2100 生物分析仪及安捷伦 DNA 1000 试剂盒分析所得的捕获前扩增样品的电泳叠加谱图。样品：FFPE DNA Q（红色），FFPE DNA A（蓝色），新鲜冷冻组织 DNA（绿色），对照 DNA（浅绿色）
所有 DNA 样品的谱图在大约 100 至 900 碱基之间十分类似。平均分子量为 307 至 348 碱基之间，最大峰高位于 254 至 271 碱基之间（表 1）。未观察到任何扩增假体或引物二聚体。此外，2100 生物分析仪可自动提供弥散条带的 DNA 浓度，其介于 23 至 90 ng/µL 之间。
表 1 捕获前扩增文库的平均分子量、峰高及定量
捕获后扩增
SureSelect 实验方案中的最后一个 DNA QC 步骤需要对捕获后样品进行 10 次循环扩增，然后采用高灵敏度 DNA 试剂盒在 2100 生物分析仪上进行分析（图 4）。观察结果表明，所有四个样品的电泳谱图较为一致，弥散条带从 225 至 600 碱基，峰高为 314 至 336 碱基（表 2）。分子量分布及 DNA 文库的产量均在 Illumina 末端配对多重测序所推荐的范围之内（2 × 76 bp 读长）。
图4. 使用 Agilent 2100 生物分析仪系统及高灵敏度 DNA 试剂盒分析所得的捕获后扩增文库的电泳叠加谱图。样品：FFPE DNA Q（红色），FFPE DNA A（蓝色），新鲜冷冻组织 DNA（绿色），对照 DNA（浅绿色）
结论
在 SureSelect 靶向序列捕获的样品前处理工作流程中，2100 生物分析仪被应用于 FFPE 样品的 NGS 样品 QC。可靠的 DNA 芯片电泳可提供弥散条带谱和详细的文库统计信息，例如峰高、平均弥散条带分子量、分子量分布和 DNA 浓度。FFPE、相匹配的新鲜冷冻组织，以及对照细胞系 DNA 所得结果适用于下游的Illumina 平台测序。
参考文献
1. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., and Bouzyk, M. M., “DNA Extraction from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue”, Cold Spring Harbor Protocols, doi:10.1101/pdb.prot5138, 2009.
2. Kirill Gromadski, Rüdiger Salowsky, Susanne Glück, “Improving sample quality for SureSelect target enrichment and next-generation sequencing with the Agilent High Sensitivity DNA kit”（采用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒提高SureSelect 靶向序列捕获及新一代测序的样品质量），安捷伦科技应用简报，出版号 5990-5008EN，2010
3. “SureSelect Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing”
（适用于 Illumina 末端配对测序的
SureSelect 靶向序列捕获系统），安捷伦科技操作手册，出版号 G7530-90000， 2012
4. “Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide”
（安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒指南），安捷伦科技操作手册，出版号 G2938-90321， 2009
5. “Agilent DNA 1000 Kit Guide”（安捷伦DNA 1000 试剂盒指南），安捷伦科技操作手册，出版号 G2938-90014，2006
© 安捷伦科技（中国）有限公司，2012
2012 年 6 月 1 日，中国出版
作者
Melissa Huang Liu
安捷伦科技有限公司
美国加利福尼亚州拉霍亚
Maria Celeste Ramirez
安捷伦科技有限公司
美国加利福尼亚州圣克拉拉
摘要
本文将介绍利用 Agilent 2100 生物分析仪系统的微控流芯片电泳，在新一代测序工作流程的 SureSelect 靶向序列捕获之前或期间，对福尔马林固定石蜡包埋组织及新鲜冷冻组织的 DNA 样品进行质量控制。借助 2100 生物分析仪系统可靠的 DNA 电泳技术，可提供弥散条带谱及详细的文库统计信息，例如峰高、平均弥散条带分子量、分子量分布和 DNA 浓度。FFPE DNA 样品的结果与新鲜冷冻组织和对照 DNA 的 DNA 分析结果具有可比性。
前言
最常用的临床样品保存和存档方法之一 是制备福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织。全世界的组织库、医院及实验室内存档的 FFPE 组织样本数超过 4 亿个。组织样本通过解剖或活检进行收集，然后用福 尔马林固定以及石蜡包埋以保持其完整性， 用于组织病理学研究及显微镜观察。收集到的这些病变组织和正常组织未来可能会成为分子遗传学研究中非常有价值的资源。但是，从 FFPE 样品中进行 DNA 提取面临巨大的挑战[1]。甲醛交联、降解以及单链和双链 DNA 相混合等常见问题会导致适合下游应用的 DNA 材料数量减少。因此，对用于新一代测序 (NGS) 等高灵敏度、成本高昂的应用的样品进行质量评估显得 尤为重要。
经验证，2100 生物分析仪是 NGS 工作流程中进行片段 DNA 和 DNA 文库分子量测定以及定量分析的一个重要工具[2]。本文将介绍利用 2100 生物分析仪的芯片电泳技术对 NGS 靶向序列捕获工作流程中的
FFPE 和新鲜冷冻 DNA 样品进行分析。
实验部分
材料
FFPE 及新鲜冷冻组织的 DNA 由西奈山医学院捐赠（美国纽约州纽约市）， NA10831-1 对照 DNA 购自科里尔研究所（美国新泽西州卡姆登）。QIAmp DNA FFPE 组织试剂盒购自 QIAGEN GmbH（德国希尔登）。Ambion RecoverAll 总核酸分离试剂盒购自 Life Technologies 公司（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）。E220样品前处理系统购自 Covaris 公司（美国马萨诸塞州沃本）。2100 生物分析仪、安捷伦 DNA 1000 试剂盒，以及安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒均来自安捷伦科技有限公司（德国瓦尔特布隆）。
样品前处理
采用 QIAGEN FFPE 组织试剂盒及 Ambion 核酸分离试剂盒提取病人 FFPE 肿瘤组织中的基因组 DNA。所有样品均采用 SureSelect 靶向序列捕获实验方案进行进一步处理[3]。
采用芯片电泳进行 DNA 质量控制
DNA 电泳采用了 2100 生物分析仪，并根据生产商的实验方案[4,5]，联用 DNA 1000 试剂盒或高灵敏度 DNA 试剂盒。并在区域 (Region) 表格中对弥散条带的浓度及平均分子量进行分析。峰高在色谱峰 (Peak) 表格中进行测定，如 SureSelect 实验方案中所述[3]。
结果和讨论
要想成功实现靶向序列捕获和 NGS，关键是在样品前处理工作流程中的特定时间点对样品质量进行评估。在本文中，源自病人 FFPE 组织的基因组 DNA (gDNA)、新鲜冷冻肿瘤组织中相匹配的 gDNA，以及对照细胞系 DNA 均根据 SureSelect 实验方案进行处理。利用 2100 生物分析仪在一些关键步骤进行 DNA 样品质量控制(QC)：剪切后片段化、捕获前扩增及捕获后扩增（图 1）。
图1. SureSelect 靶向序列捕获的样品前处理工作流程。需要 DNA QC 的步骤以红色框标识（A：剪切后，B：捕获前扩增，C：捕获后扩增）
剪切后片段化分析
源自 FFPE 样品的 DNA 采用两种不同的方法进行提取 — QIAGEN FFPE 组织试剂盒 (FFPE DNA Q) 和 Ambion 核酸分离试剂盒(FFPE DNA A)，并与相匹配的新鲜冷冻组织提取的 DNA 及对照 DNA 进行比较。所有样品均采用 Covaris 系统进行片段化。剪切后样品采用 DNA 1000 试剂盒分析(图2），结果显示各样品均出现 100 至 450 碱基的弥散条带。除了分子量及纯度信息外，100 生物分析仪还可提供每个样品的总 DNA 浓度，并对特定区域内的弥散条带定量。
图2. 剪切后的片段分布。使用 Agilent 2100 生物分析仪及安捷伦 DNA 1000 试剂盒分析样品所得的胶图及电泳叠加谱图。样品：FFPE DNA Q（红色），FFPE DNA A（蓝色），新鲜冷冻组织
DNA（绿色），对照 DNA（浅绿色）
捕获前扩增
四个 DNA 样品按照样品前处理工作流程（图 1）进行进一步处理。对捕获前扩增样品进行五次 PCR 循环，然后采用 DNA 1000 试剂盒在 2100 生物分析仪上进行分析（图 3）。
图3. 使用 Agilent 2100 生物分析仪及安捷伦 DNA 1000 试剂盒分析所得的捕获前扩增样品的电泳叠加谱图。样品：FFPE DNA Q（红色），FFPE DNA A（蓝色），新鲜冷冻组织 DNA（绿色），对照 DNA（浅绿色）
所有 DNA 样品的谱图在大约 100 至 900 碱基之间十分类似。平均分子量为 307 至 348 碱基之间，最大峰高位于 254 至 271 碱基之间（表 1）。未观察到任何扩增假体或引物二聚体。此外，2100 生物分析仪可自动提供弥散条带的 DNA 浓度，其介于 23 至 90 ng/µL 之间。
| 样品 | 平均分子量 [bp] | 峰高 [bp] | 浓度 [ng/µL] |
| FFPE DNA Q | 307 | 264 | 34.8 |
| FFPE DNA A | 309 | 254 | 22.6 |
| 冷冻组织 DNA | 331 | 264 | 89.5 |
| 对照 DNA | 348 | 271 | 23.2 |
捕获后扩增
SureSelect 实验方案中的最后一个 DNA QC 步骤需要对捕获后样品进行 10 次循环扩增，然后采用高灵敏度 DNA 试剂盒在 2100 生物分析仪上进行分析（图 4）。观察结果表明，所有四个样品的电泳谱图较为一致，弥散条带从 225 至 600 碱基，峰高为 314 至 336 碱基（表 2）。分子量分布及 DNA 文库的产量均在 Illumina 末端配对多重测序所推荐的范围之内（2 × 76 bp 读长）。
图4. 使用 Agilent 2100 生物分析仪系统及高灵敏度 DNA 试剂盒分析所得的捕获后扩增文库的电泳叠加谱图。样品：FFPE DNA Q（红色），FFPE DNA A（蓝色），新鲜冷冻组织 DNA（绿色），对照 DNA（浅绿色）
| 样品 | 平均分子量[bp] | 峰高[bp] | 浓度[pg/μl] |
| FFPE DNA Q | 357 | 316 | 572.0 |
| FFPE DNA A | 348 | 314 | 609.4 |
| 冷冻组织DNA | 376 | 340 | 676.3 |
| 对照DNA | 382 | 336 | 415.2 |
表 2 捕获后扩增文库的平均分子量、峰高及定量
结论
在 SureSelect 靶向序列捕获的样品前处理工作流程中，2100 生物分析仪被应用于 FFPE 样品的 NGS 样品 QC。可靠的 DNA 芯片电泳可提供弥散条带谱和详细的文库统计信息，例如峰高、平均弥散条带分子量、分子量分布和 DNA 浓度。FFPE、相匹配的新鲜冷冻组织，以及对照细胞系 DNA 所得结果适用于下游的Illumina 平台测序。
参考文献
1. Tang, W., David, F. B., Wilson, M. M., Barwick, B. G., Leyland-Jones, B. R., and Bouzyk, M. M., “DNA Extraction from Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Tissue”, Cold Spring Harbor Protocols, doi:10.1101/pdb.prot5138, 2009.
2. Kirill Gromadski, Rüdiger Salowsky, Susanne Glück, “Improving sample quality for SureSelect target enrichment and next-generation sequencing with the Agilent High Sensitivity DNA kit”（采用安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒提高SureSelect 靶向序列捕获及新一代测序的样品质量），安捷伦科技应用简报，出版号 5990-5008EN，2010
3. “SureSelect Target Enrichment System for Illumina Paired-End Sequencing”
（适用于 Illumina 末端配对测序的
SureSelect 靶向序列捕获系统），安捷伦科技操作手册，出版号 G7530-90000， 2012
4. “Agilent High Sensitivity DNA Kit Guide”
（安捷伦高灵敏度 DNA 试剂盒指南），安捷伦科技操作手册，出版号 G2938-90321， 2009
5. “Agilent DNA 1000 Kit Guide”（安捷伦DNA 1000 试剂盒指南），安捷伦科技操作手册，出版号 G2938-90014，2006
© 安捷伦科技（中国）有限公司，2012
2012 年 6 月 1 日，中国出版
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