由于多肽药物结构复杂、稳定性差、浓度低且目标分子与杂质的结构相类似，有的只有一个氨基酸的差别，因此多肽药物的分离纯化一直是多肽药物生产过程中最具挑战性的一部分，多肽分离纯化也主要依赖于高性能的微球制备色谱填料，其具有分离效果好、分辨率高、重复性好、回收率高等优点，是目前多肽药物的主要分离纯化方法。无论是多肽药物的合成还是分离纯化都离不开高性能的微球材料。

 

 

 

传统重结晶、精馏等有机小分子药物纯化方法不适用于多肽的分离纯化，高效液相色谱或层析技术具有极高的分离纯化效率，且条件温和，在分离纯化过程中容易保持目标分子的生物活性，成为多肽药物分离纯化的重要工具。

 

分离纯化技术对于生物分子的形态、收率和成本具有决定性的作用。尤其是通过发酵生产的多肽药物如重组胰岛素，由于浓度低、杂质复杂，目标产物容易变性等使其分离成本占总成本的60%以上，而且需要多步纯化过程才能满足多肽药物的需求，因此，分离纯化技术在多肽药物产业中起着十分重要的作用。

 

目前用于多肽药物分离纯化的层析或色谱技术主要是有三种: 

 

一是离子交换色谱，由于多肽是由氨基酸通过酰胺键连接成的高分子物质，不同多肽分子带的表面电荷正负性质及表面电荷数量都不同而且会随着流动相的pH改变而改变，因此不同组份的多肽分子在离子层析介质的电荷作用力有较大差异，因此可以通过改变水溶液的盐浓度和pH来降低样品组份与离子交换色谱填料的电荷作用力从而对不同多肽组份进行洗脱分离。

 

离子交换树脂分为强阳、强阴、弱阳、弱阴四种常用离子交换介质，离子交换具有载量大、适用性强等特点，因此常被用于发酵多肽产品的粗分和中间纯化过程，如重组胰岛素的第一步粗分往往是用离子交换色谱。

 

二是反相色谱，多肽分子在极性较强的流动相如水的缓冲液中可以与色谱填料表面疏水基团形成较强的疏水作用力而吸附在固定性表面上，然后通过降低流动相极性即增加流动相有机溶剂的比例如甲醇、乙腈等按极性强弱先后洗脱分离不同多肽样品组分。

 

样品流出色谱柱的顺序是极性较强的多肽组份最先被冲洗出，而极性较弱的组份会与色谱填料有更强的疏水作用力因此在色谱柱上有更强的保留。反相色谱填料分辨率很高通常用于多肽药物分离的精纯过程。

 

三是疏水作用色谱，与反相色谱相类似都是通过样品组份带有的疏水基团与色谱填料表面基团通过疏水作用力达到吸附的目的，然后通过调整流动相性质来改变这种疏水作用力来达到分离的目的。

 

不同的是反相填料具有高密度的疏水功能基团，疏水作用力很强，样品组分在纯水缓冲溶液中就可以吸附在反相填料表面，洗脱时需要增加流动相中有机溶剂的比例以降低流动相的极性；而疏水填料表面疏水基团密度小，疏水作用力较弱，为了增加多肽的疏水作用力，在水流动相中需要增加盐的浓度使样品能吸附在疏水填料表面，然后只要降低流动相盐的浓度就可以达到洗脱的目的。

 

疏水作用色谱优势是可以完全在水相体系操作，不需要有机相。常见的疏水基团有苯基、丁基和聚醚基团。疏水层析介质的疏水作用力主要受流动相的盐浓度影响，由于其在高盐环境下，多肽分子的疏水性较好，因此其非常适用于离子交换色谱过程之后产品的继续分离纯化。

 

 

 

  01 

「 多肽分离纯化色谱填料的选择 」

一个理想的多肽药物分离纯化色谱填料必须满足以下特性：

（a）高选择性，高分离度；

（b）柱效高，分辨率高；

（c）载量大；单位体积填料处理多肽样品的能力大

（d）化学性能稳定，适用pH范围宽（1-14）；可在线清洗， 耐脏性强，使用寿命长；

（e）机械强度大，反压低；易装柱；

（f）产品重现性好，性价比高。在现实中很难找到一款填料能满足所有的要求，每种填料都有它自身的特性，选择填料要综合考虑成本，分离效率，产品纯度，稳定性等等。

 

 

如在发酵多肽的粗纯或捕获阶段需要高载量色谱填料来浓缩和分离目标多肽分子，而精纯阶段则要选择分辨率高的介质以除去性能非常类似的分子。由于色谱填料的性能取决于其化学组成、粒径大小和分布、微球孔径大小和分布、表面功能基团及密度等。

 

用于多肽分析和分离纯化的液相色谱填料主要基质有三大类：

第一类是多孔二氧化硅（硅胶）为基质的色谱填料；

第二类是天然碳水高分子改性填料包括改性纤维素、葡聚糖、琼脂糖等；

第三类是合成高分子色谱填料包括交联聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯等。

 

反相硅胶色谱已成为多肽分析和制备色谱的主流介质, 但硅胶表面的硅氧键耐碱性差的缺点使得这一填料不适合在碱性条件下分离和分析多肽分子和需要用碱性条件下再生的纯化分离过程中。

 

天然碳水高分子改性填料由于具有亲水强，能减少对生物分子的非特异性吸附等特点因此在分离过程中容易保持生物分子的生物活性而被广泛地用于生物大分子的分离纯化，其主要的缺点是机械强度差，溶胀体积大，流速慢等等。

 

交联聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸酯由于机械强度好且合成聚合物微球的粒径,粒径分布及孔道结构容易控制，通过表面亲水化改性后可以降低生物分子的非特异性吸附，而且克服了天然碳水高分子介质机械强度差，溶胀体积大的缺点使生物分离纯化更加快速、高效。

 

因此合成高分子填料被越来越多地替代天然高分子改性填料用于多肽分子的分离纯化。交联聚苯乙烯填料由于本身就带有疏水的苯基，不需要通过表面键合烷基功能基团就可直接用作反相填料，交联聚苯乙烯填料具有较强的机械强度及极高的耐碱性和极长寿命等特点使其被越来越多地用来替代反相硅胶用于中小分子工业分离纯化过程中。

 

用于多肽分析和分离纯化的液相色谱填料主要基质性质对比

 

1）硅胶色谱填料

 

在高效液相色谱领域，二氧化硅(硅胶)及硅胶键合分离填料因具有良好的机械强度，耐溶剂性，孔道结构及比表面积容易控制，优异的耐热性能，及表面富含易于键合或改性的硅羟基使得硅胶成为高效色谱填料应用历史最悠久也是应用最为广泛的高效液相色谱填料。

 

 

2）聚合物色谱填料

 

然而在多肽类药物的研究与开发中，往往因在下游的分离与纯化过程中所存在的技术瓶颈，导致难以获得令人满意的目标多肽或制备规模。

 

聚合物分离介质因其良好的分离效果、稳定的物理化学性质及高吸附载量，在多肽类药物的分离与纯化中得到越来越广泛的应用，也为多肽的分离介质选择提供了新的途径。

 

按照聚合基体的不同，聚合物可以分为聚苯乙烯型和甲基丙烯酸型，分别是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯为聚合单体，加入致孔剂聚合而成。

 

早期的聚合物分离介质因孔径较大，称为大孔吸附树脂，其性质介于天然吸附剂（活性炭、硅胶和硅藻土）和离子交换剂之间。

 

目前大孔吸附树脂已广泛应用于中药提取液及多肽的分离纯化，但因大孔吸附树脂本身粒径较大等因素导致其分离能力较低，在物质的精细分离纯化中很难达到所需的纯化要求及质量标准。

 

随着聚合技术的发展，新型的精细聚合物分离介质随之诞生。精细聚合物分离介质一般是以苯乙烯和二乙烯基苯或甲基丙烯酸酯为单体聚合而成，其粒径分布为数微米至数百微米，具有更窄的粒径分布、更优化的孔径结构及更高的比表面积，因此拥有更好的分离度和吸附载量。 

 

与反相硅胶色谱填料相比，首先，聚合物色谱填料微球的骨架结构是由C-C键构成，比Si-O-Si键以及多糖的糖苷键，其化学稳定性最好，在整个pH范围内都可以长期使用，还能用NaOH 溶液直接清洗和再生；

 

其次，通过聚合方法，可以很容易地获得从软凝胶型至不同硬度，不同孔径、不同大小的微球，特别是通过化学方法，对微球进行功能化，可以很容易地获得具有各种表面性质的微球。因此，越来越多的被用来替代反相硅胶用于多肽等生物分子工业纯化过程中。

 

 

3）聚合物和反相硅胶色谱填料的互补性能

 

硅胶和聚合物为基质的填料是色谱分离和分析领域必不可少的两种性能互为补充的色谱介质。

 

硅胶基质机械强度大、柱效高、分辨率好，已广泛应用于有机化合物及中性分子的分析和大规模制备生产中；而聚合物基质填料则具有良好的化学稳定性及无与比拟的耐酸碱性，因此使用寿命长，可在线清洗适合生物分子的大规模纯化分离。

 

研究证明，由于硅胶和聚合物色谱填料内存在材料基质的差别，它们在对目标分子分离选择性方面具有极强的互补性，如一些用聚合物填料很难分离的物质，在硅胶填料上却能得到良好分离。 

 

相反地，一些在硅胶填料上很难分离的物质，而用聚合物填料能得到有效的分离。纳微科技可同时提供硅胶、聚甲基丙烯酸酯和聚苯乙烯/二乙烯基苯为基质的三种性能互补的高质量的单分散均粒色谱填料以满足不同客户的需求。

 

 

  02 

「 色谱填料孔径对多肽分离纯化的影响 」

 

除了体积排阻色谱外，其它色谱分离机理都离不开样品与色谱填料表面的作用。

 

色谱填料孔径大小、分布及比表面积对多肽分离性能也有重大的影响，对于分子量小于1000的多肽样品，一般选择孔径在100Å 以下的就可以。

 

对于大多数分离模式来说有效的比表面积越大，载量越大，但有效比表面积取决于目标样品的分子量、孔径大小及孔容积。

 

这里指的有效比表面积是针对特定物质分离条件下有用的孔道比表面积总和，无效的比表面积是指孔径小于一定尺寸，目标分子不能进出，在分离过程这些小于一定尺寸的孔道所产生的比表面积不能起到分离作用，因此要根据分离的样品的分子量来选择合适孔径的色谱填料。

 

如胰岛素分子量大概在6000左右，如果使用C8反相硅胶色谱填料分离纯化，一般选用粒径10微米，孔径100Å左右的色谱填料；

如果选用孔径小于80Å的C8硅胶色谱填料，虽然测得该填料比表面积比孔径100Å色谱填料要大，但该色谱填料分辨率和载量会比100Å色谱填料低很多；

如果选择孔径过大的色谱填料，如200Å的色谱填料，该填料比表面积比100Å的相对会减小，导致载量降低，同时孔径大的硅胶填料机械强度也比孔径小的机械强度要差。

 

对于聚合物色谱填料需要的孔径会比硅胶要大，一般300Å聚合物色谱填料就相当于100Å硅胶色谱填料。

 

如果孔径保持一致条件下，孔容积越大，比表面积也越大，单位体积的硅胶含量越少，因此机械强度则越差。

 

在其它条件不变，一般选择有效比表面积越大的填料越好，这样载量大，机械强度好。一般来说孔容积越大载量越大，分离效果也越好，但孔容积越大，机械强度越差。因此对于一般多肽分析和分离用色谱填料孔容积要求在0.5-1.0ml/g左右，如果用于体积排阻利用分子筛性质的填料孔容积要求会大于1.3ml/g。

 

另外小于50Å的微孔的存在对部分样品组分的分离效果有影响，因此在做硅胶表面键合之前最好把这些微孔封掉。

 

常规色谱填料粒径大小分别有1.7、3、5、8、10、12、15、20、30、40、50微米；常规孔径可选择0.05nm（50Å）、0.1nm（100Å）、0.12nm （120Å）、0.17nm （200Å）、0.3nm （300Å）、0.1nm（500Å）。因此要根据目标多肽样品的分子量选择合适孔径色谱填料。

 

 

 

  03 

「 填料粒径大小及均一性对多肽分离纯化的影响 」

 

色谱填料的粒径主要影响填充柱的的柱效和背压。填料粒径越小，填充柱的柱效越高，在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度。填料粒径越小，柱压也越高，因此对色谱系统的要求也越高，设备投资也越大，小粒径色谱填料的价格也高。

 

因此用于工业制备的色谱填料颗粒粒径往往在10微米以上, 常规HPLC色谱柱硅胶填料粒径在3-5微米之间, 而用于UPLC 的色谱填料在2微米以下。

 

选择色谱粒径大小要综合考虑分离效率和成本。下图是用纳微科技UniPS系列不同粒径聚合物色谱填料（粒径分别为10、20、30微米）对多肽、蛋白等分离效果的影响。

 

 

不同粒径的色谱填料对多肽和蛋白质分离效果的对比

 

 

除了粒径的大小外，色谱填料的粒径分布情况也是色谱填料性能的重要参数。在高效液相色谱分离过程中，流动相流过的通路主要是粒状填料间的间隙，而填料粒径大小、均一性及填充柱床紧密程度的不均一性，都会使填充柱产生多路径效应。

 

使溶质分子在填充柱床中的流动路径和保留时间发生变化，导致色谱峰变宽，从而影响溶质分子分离效果。

 

当色谱微球填料粒径分布较宽，相同的溶质分子流过色谱柱时，在填充柱床内产生不同的通路，导致经过的路径长短不同，相应的保留时间也有所不同，使色谱峰展宽，理论塔板数变小，柱效降低。

 

当使用粒径均一的微球填料填充色谱柱时，因其紧密程度一致，有效减少了填充床的多路径效应，使溶质分子流过色谱柱时经历的路径长度基本相同，相应的保留时间也较一致，使色谱峰宽变窄，理论塔板数升高，从而获得较高的柱效（粒径均一性对分离柱效的影响如图8所示），在小分子及多肽的反相分离中获得较好的分离效果。

 

 

粒径均一性对分离柱效的影响

 

用于多肽药物分离纯化的色谱填料要求极高，因此制备技术壁垒高，世界上真正具备规模化生产能满足色谱需求的多分散多孔球形硅胶的厂家只有Kromasil, Daisol，Fuji及Merck等四家。 

 

而可以生产聚合物色谱填料的厂家主要有美国GE，日本Tosoh 等少数公司。目前大多数市场上的色谱填料无论是硅胶基质还是聚合物基质粒径分布都较宽，因此开发单分散色谱填料的技术一直是业界的发展目标，也是该领域的技术难题。

 

纳微科技致力于研究单分散微球材料的制备和应用的高科技企业，不仅成功地开发出单分散多孔聚合物微球，而且成为世界第一家开发出单分散硅胶填料的大规模生产技术，并获得国家发明专利。

 

先进微球材料是多肽药物发展的基础，无论是用于多肽固相合成的微球载体还是用于分离纯化和检测的色谱填料都离不开高性能微球材料，微球材料制备技术的进步会促进多肽药物产业的发展。

 

苏州纳微科技股份有限公司（简称纳微）专门从事高精度、高性能和高附加值微球材料研发和生产的国家高新技术企业，致力于建设世界领先的纳微米球精准制备和应用平台，是世界上能提供最多微球品种与规格的公司之一。

 

纳微拥有单分散色谱填料的精准制备技术、表面功能化技术和规模化生产能力；产品涵盖硅胶正相、反相、HILIC、手性填料，聚合物反相、离子交换、疏水层析、亲和层析（ProteinA、金属螯合、苯硼酸）、固相萃取、凝胶渗透色谱及特殊功能填料；还提供色谱柱、磁珠、标准颗粒、分析检测、分离纯化实验技能培训及分离纯化整体解决方案。纳微已实现大规模出口高性能色谱填料到欧、美、日、韩等国家和地区的国际知名制药和色谱企业，成为世界色谱行业的领军企业之一。

 

纳微承担国家战略性新兴产业发展专项（2013年蛋白类生物药和疫苗发展专项）、国家科技支撑计划项目课题，建成江苏省纳微米球材料工程中心及工程技术研究中心，成立苏州纳微先进微球材料应用技术研究所，已获得国家发明专利19项，获1项国家重点新产品和4项江苏省高新技术产品。

 

纳微在苏州工业园区建成13000m²的研发及生产中心，2019年在常熟建成18000m²的生产基地，纳微已通过ISO9001质量管理体系认证，为客户提供完善的技术支持文件。纳微始终坚持“以创新，赢尊重，得未来”的理念，致力于打造具有国际影响力的纳微米球材料国家企业技术中心。

 

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