• 样品偶联方案

以下方案旨在为生物分子与带有不同表面基团的微球的偶联提供一般指导。但可能还需要进行优化以实现最佳的活性和稳定性，同时最大程度地减少非特异性结合特性。
A. 羧基修饰的微球试剂：
1. 羧基修饰的微球（通常以10％的固体含量提供）
2. 活化缓冲液（pH 4.5-7.5）*（MES缓冲液是常见选择）。
3. 偶联缓冲液（pH 7.2-8.5）[应避免使用含有游离胺的缓冲液，例如Tris或甘氨酸。]
4. 水溶性碳二亚胺（WSC）[例如 EDC，CMC等] **
5. 蛋白质或其他生物分子
6. 用30-40 mM的伯胺源淬灭溶液[例如 羟胺，乙醇胺，甘氨酸等]和0.05-1％（w / v）的阻断分子
7. 具有0.01-0.1％（w / v）阻断分子的储存缓冲液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的活化缓冲液中洗涤1mL（100 mg / mL）的微球2次。***
2. 第二次洗涤后，将沉淀重悬于10mL的活化缓冲液中，确保微球悬浮良好。 （涡旋，超声处理或滚动应有助于重悬。）注意：微球悬浮液的浓度现在为10 mg / mL。
3. 混合时，加入100mg的WSC。 （添加WSC可能会导致结块；通常不会引起太大的关注，应该通过与生物分子孵育来解决[步骤6-7]。）
4. 在室温（18-25°C）下反应15分钟，并连续搅拌。
5. 在偶联缓冲液中洗涤2次，并重悬于5mL的相同缓冲液中。像步骤2中一样，尽可能确保颗粒被很好地悬浮。
6. 在5mL偶联缓冲液中溶解蛋白质（超出计算的单层1-10倍）。结合微球悬浮液和蛋白质溶液。
7. 在室温下持续搅拌2-4小时。
8. 洗涤，重悬于10mL淬灭溶液中，并轻轻混合30分钟。洗涤并重悬于存储缓冲液中至所需的存储浓度（通常为10 mg / mL）。
9. 存放在4℃直到使用。
* 加入WSC后的反应速率取决于pH（随着pH降低，反应速率增加）。
**  EDAC或EDC：1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
Hydrochloride
CMC：1-Cyclohexyl-2-(2-morpholinoethyl) carbodiimide
Metho-p-toluenesulfonate
备择方案：
1. 一步耦合反应，即碳二亚胺，蛋白质和微球在一个步骤中结合在一起，对于耦合较大的分子通常是有问题的，但已有效地用于较小的分子（如类固醇和半抗原）的耦合。
2. 可以加入水溶性的磺基-N-羟基琥珀酰亚胺以提高偶联效率。 由N-羟基化合物形成的活性酯中间体替代由WSC形成的邻酰基脲脲中间体（不稳定），对水解更稳定，但仍对要偶联的蛋白质上的胺具有高反应性。
B. 氨基修饰的微球
试剂：
1. 氨基修饰的微球（通常以10％的固体含量提供）
2. 胺反应性同双功能交联剂（例如戊二醛，酰亚胺酯或NHS酯。）
3. 洗涤/偶联缓冲液（pH 6.0-9.0）（请参见第二部分，缓冲液。）
4. 蛋白质或其他生物分子
5. 用30-40 mM的伯胺源淬灭溶液[例如 羟胺，乙醇胺，甘氨酸等]和0.05-1％（w / v）的阻断分子
6. 具有0.01-0.1％（w / v）阻断分子的储存缓冲液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的洗涤/偶联缓冲液中洗涤1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次洗涤后，将沉淀重悬于10mL戊二醛溶液中（戊二醛溶解在洗涤/偶联缓冲液中至终浓度10％）*，确保微球完全悬浮。 （涡旋，超声处理或滚动就足够了。）注意：微球悬浮液的浓度现在为10 mg / mL。
3. 在室温（18-25°C）下反应1-2小时，并持续搅拌。
4. 洗涤2次，重悬于5mL洗涤/偶联缓冲液中，并确保将颗粒完全重悬，如步骤2所示。
5. 在5mL洗涤/偶联缓冲液中溶解蛋白质（超出计算的单层1-10倍）。结合微球悬浮液和蛋白质溶液。
6. 在室温下连续搅拌2-4小时。
7. 洗涤，重悬于10mL淬灭溶液中，并轻轻混合30分钟。洗涤并重悬于存储缓冲液中至所需的存储浓度（通常为10 mg / mL）。
8. 存放在4℃直到使用。
*戊二醛应大量添加，以使微球上的氨基饱和，从而避免在配体连接之前微球之间的交联。 添加的数量需要优化，因为戊二醛过多可能会改变蛋白质的天然构象，从而降低其生物活性。
备择方案：
1. 除戊二醛外，各种长度的胺反应性同双功能交联剂都可用于形成间隔臂，从而使共价偶联的蛋白质从表面上以不同的长度引出。
2. 氨基和醛之间形成的键形成可逆的席夫碱，必须通过称为还原烷基化的方法将其还原，以使键共价。 常用的还原剂包括氰基硼氢化钠，胺硼烷和吡啶硼烷。但是，由于每种蛋白质上的几个氨基都与微球上的醛基相互作用，因此有时认为在偶联大多数蛋白质时无需还原这些键，例如抗体。
C. 羟基修饰的微球
试剂：
1. 羟基改性的微球（通常以10％的固体含量提供）
2. 2 M碳酸钠（活化缓冲液）
3. 氰化溴化物（CNBr）
4. 乙腈（C₂H₃N）[用于溶解CNBr]
5. 蛋白质或其他生物分子
6. 洗涤/偶联缓冲液（pH 8.0-9.0）。 （避免使用含胺的缓冲液，如Tris或甘氨酸，它们会与配体竞争偶联位点。 请参见第二节，缓冲液。）
7. 用30-40 mM的伯胺源淬灭溶液。 （羟胺，乙醇胺，甘氨酸等）和0.05-1％（w / v）的阻断分子。
8. 具有0.01-0.1％（w / v）阻断分子的储存缓冲液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的洗涤/偶联缓冲液中洗涤1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次清洗后，重悬于9.5mL的活化缓冲液中，确保微球完全悬浮。 （涡旋，超声处理或滚动就足够了。）
3. 在通风橱中，将1g CNBr（或1g CNBr：100mg微球的比例）溶解在0.5mL乙腈中。 （警告：CNBr具有很高的危险性，应在通风橱中使用所有适当的预防措施进行处理。）
4. 将CNBr溶液（滴加）添加到搅拌的微球悬浮液中，并使活化反应在室温（18-25°C）下精确地持续2分钟。注意：微球悬浮液的浓度现在为10 mg / mL。
5. 在大量的冰冷水中快速洗涤活化的微球，然后用冷偶合缓冲液洗涤。 5mL冷偶合缓冲液（4˚C）重悬微球。将要偶联的配体溶解在5mL偶联缓冲液中，其浓度对应于计算出的单层1-10X过量，结合微球悬浮液和蛋白质溶液。
6. 在持续搅拌下，将悬浮液在4°C下保持24小时。
7. 洗涤，重悬于10mL淬灭溶液中，并轻轻混合30分钟。洗涤并重悬于存储缓冲液中至所需的存储浓度（通常为10 mg / mL）。
8. 存放在4℃直到使用。
备择方案：
1. 1-cyano-4-dimethylaminopryidinium tetrafluoroborate可以代替CNBr，因为它是不挥发的，毒性较小的化学药品，具有较长的半衰期。
2. 也可以使用Tosyl Chloride, Tresyl Chloride or carbonyl diimidazole活化剂代替溴化氰。
D. 酰肼修饰的微球
试剂：
1. 酰肼改性的微球（通常以10％的固体含量提供）
2. 洗涤/偶联缓冲液（pH 5.0-7.0）
3. 蛋白质
4. 100 mM偏高碘酸钠（NalO₄）
5. 具有0.01-0.1％（w / v）阻断分子的储存缓冲液（pH 7.0-7.5）
程序：
A. 蛋白质的氧化（注意：该反应对光敏感，应在黑暗中进行。）
1. 在1mL的洗涤/偶联缓冲液中溶解或稀释1-10X过量的计算的单层蛋白质。
2. 将蛋白质溶液添加到含有1mg偏高碘酸钠的琥珀色小瓶中：20mg蛋白质； 轻轻旋转以溶解氧化剂。
3. 不断搅拌下，将样品在室温下孵育30分钟。
4. 通过使混合物通过用偶联缓冲液平衡的脱盐柱（例如Sephadex™G25或PD10）终止反应并除去未反应的NalO₄。
B. 偶联至肼修饰的乳胶微球
1. 在10mL的洗涤/偶联缓冲液中洗涤1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次洗涤后，将微球重悬于9mL洗涤/偶联缓冲液中，确保微球完全悬浮。
3. 将9mL的微球悬浮液与1mL的氧化蛋白质悬浮液混合。 （注意：现在浓度为10 mg / mL。）在室温（18-25°C）下混合至少反应6个小时。
4. 洗涤，重悬于含有0.05-1％（w / v）阻断分子的10mL洗涤/偶联缓冲液中，轻轻混合30分钟。
5. 洗涤，然后重悬于存储缓冲液中至所需的存储浓度（通常为10 mg / mL）。
6. 储存在4℃直到使用。
备择方案：
另一种选择是使用戊二醛激活微球，使用的方法与氨基修饰的微球相同。​
E. 氯甲基修饰的微球
试剂：
1. 氯甲基改性的微球（通常以10％的固体含量提供）
2. 蛋白质或其他生物分子
3. 洗涤/偶联缓冲液（pH 7.5）
4. 用30-40 mM（例如羟胺，乙醇胺，甘氨酸等）和0.05-1％（w / v）阻断分子的伯胺源淬灭溶液。
5. 具有0.01-0.1％（w / v）阻断分子的储存缓冲液（pH 7.0-7.5）
程序：
1. 在10mL的洗涤/偶联缓冲液中洗涤1mL（100 mg / mL）的微球2次。
2. 第二次洗涤后，重悬于5mL洗涤/偶联缓冲液中，确保微球完全悬浮。 （涡旋，超声处理或滚动就足够了。）
3. 在5mL洗涤/偶联缓冲液中溶解蛋白质（超出计算的单层1-10倍）。 结合微球悬浮液和蛋白质溶液。注意：微球悬浮液的浓度现在为10 mg / mL。
4. 在室温（18-25°C）下持续搅拌2-4小时。
5. 洗涤，重悬于10mL淬灭溶液中，在室温下轻轻混合30分钟。
6. 洗涤并重悬于存储缓冲液中至所需的存储浓度（通常为10 mg / mL）。
7. 存放在4℃直到使用。
注意：氯甲基微球可以分类为预活化的，因为微球上的氯甲基会直接与可用的氨基反应，而无需任何预处理步骤。 由于这些氯甲基的高反应性，它们会随着时间的推移在水性悬浮液中脱卤化氢，因此合成后的保存期限有限。 然而，一旦配体被偶联，它们的稳定性就与任何其他配体包被的微球的稳定性相匹配。

其它偶联方案
A. 与非功能化聚合物微球的偶联

1. 聚苯乙烯（PS）

可以通过四个步骤将生物分子共价偶联到普通的聚苯乙烯微球上：表面苯乙烯环的硝化； 硝基转化为芳族胺基； 芳族胺基团的重氮化形成重氮化合物； 并与蛋白质的酪氨酸残基偶联。

1. 聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）

PMMA微球并未广泛用于配体的共价偶联； 然而，甲酯基将容易与肼反应，产生酰肼反应位点。
B. 与非功能化二氧化硅微球的偶联
已有文献报道了硅烷化的核酸（寡核苷酸，PCR产物）与未修饰的玻璃表面的偶联。可以将这种方法进行修饰，以将硅烷化的生物分子与二氧化硅微球偶联。
C. 表面官能团的转化
可以将微球上的一个表面官能团转化为另一个。例如，胺改性的微球可通过琥珀酸酐反应转化为羧基改性的微球；相反，羧基可通过碳二亚胺介导的二胺的连接而转化为胺基；巯基改性的微球可通过胺官能化的微球反应制得。这些和其他转化可用于拓宽各种配体的连接方案。
D. 小分子的共价结合
小分子（半抗原，激素，药物等）的共价结合可能会带来特殊的困难，需要创造性的解决方案，例如载体分子和各种类型的交联剂的组合。 可以使用间隔物/交联剂从小球的表面延伸小分子，从而减少空间位阻并允许小分子与样品中的靶分子相互作用。 具有可用表面基团（例如BSA，聚赖氨酸）的载体分子可能被吸附到微球表面，随后小分子与载体分子的反应基团发生共价偶联。 或者，可以先将小分子与载体分子共价偶联，然后将载体/小分子复合物吸附到微球。 然后可以将吸附的载体分子彼此共价连接，以防止它们从颗粒中解吸/丢失。