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高通量PCR/qPCR体系构建新方法和新应用

2021-05-18     来源:腾泉生物     点击次数:4379

PCR/qPCR技术广泛应用于各种分子生物学检测领域。疫情之下,高通量的PCR检测需求日趋上升,为了解决手工移液操作的失误风险和操作难度,SPT Labtech公司的mosquitodragonfly discovery液体工作站以超高精度的液体处理能力配合检测试剂盒的优秀性能,可以将PCR技术应用到更高密度的检测模式中,适应如今的检测需求和通量。
mosquito LV
25 to 1200 nL
mosquito HV
500 nL to 5 mL
dragonfly
200 nL to 4 mL
 
一、移液精准可重复性高
在PCR和qPCR加样过程中,尤其在配置96孔或者384孔反应板时,采用高通量高精度的自动化移液系统来进行实验体系构建,可以避免在高压工作下人工疲劳操作带来的不均一性,减小实验误差,并提高样本处理效率。
mosquito和dragonfly discovery独有的固相置换技术,可以无视液体粘度和表面张力进行精准加样,对于不同的液体如PEG、乙醇或gDNA都无需调整液体参数,在1uL加样下,CV值<3%。
固相置换技术:8/16通道接触式移液(左:mosquito);多通道非接触式分液(右:dragonfly discovery)
 
二、用更少的试剂样本做更多实验
PCR实验体系的微缩化可以帮助研究人员降低试剂使用的成本。更重要的是,对于一些珍贵样本(比如来自患者的临床样本,或者样本库的存档样本),它们往往具有很高的临床价值但是总量非常稀少,实验体系的微缩化能有效节省样本用量,使得这些样本可以进行多次分析。
使用mosquitodragonfly discovery进行PCR、qPCR体系建立,可以将常规的反应体积从25μL降低至2μL,并且对实验结果没有任何影响。
小体积分液(左:mosquito,右:dragonfly discovery)
 
三、快速制备反应体系
mosquito和dragonfly discovery移液速度非常快。使用mosquito进行一块384孔板的移液只需要3分钟,使用dragonfly discovery进行一块384孔板的试剂分液只需要30秒。并且软件操作界面简洁友好,操作十分简便。
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PCR/qPCR体系构建流程
 
1、应用案例1
由于mosquitodragonfly discovery的小体系加样非常精准,可以轻松地将常规PCR体系从40μL微缩化到了2uL,同时保证了实验结果的灵敏度和特异性。
图:将反应体系微缩化到了2uL, 在保持DNA模板不变的情况下,摸索了微缩化后各个组分试剂的用量
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图:将反应体系微缩化到了2uL, 并同时摸索了模板DNA和其他试剂的用量,把样本起始量降低到了40pg
2、应用案例2
分别使用mosquito LVmosquito HVdragonfly discovery制备qPCR反应体系(KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2X) Universal)。实验结果表明,在反应体系减少15倍的情况下,依然获得了精确且重复性高的结果。
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对于mosquito HV,单独添加每种试剂成功将化体系微缩化至1.5μL (下图A, Ct=20.90; CV=0.2),预混试剂后加样成功微缩化至1μL (下图B,Ct=25.68; CV=0.7)。对于mosquito LV,不论单独添加每种试剂或预混后加样,均将总体系降低至0.6μL (下图C, Ct=18.04; CV=1.7; 下图D, Ct=25.44;CV=0.9)。使用dragonfly discovery建立微缩化qPCR体系,单独添加每种试剂时总体系为0.8μL (下图E, Ct=18.27; CV=1.5),预混试剂加样时总体系为0.6μL (下图F, Ct=25.92; CV=0.8)。
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qPCR扩增曲线
3、应用案例3
马里兰大学基因组学服务实验室使用CDC推荐的COVID-19检测方法,搭配SPT Labtech mosquito HV和dragonfly discovery液体处理工作站进行自动化qPCR体系建立,建立了大规模快速检测平台,为抗击新冠肺炎疫情做出贡献。每天可进行多达20000次检测,极大地增加了检测通量和效率。
图:新冠病毒检测workflow
图:mosquito和dragonfly discovery体积小巧,可以轻松的整合在各类层流罩或超净台中,节约实验室空间
 
使用mosquitodragonfly discovery进行微缩化、自动化的PCR体系建立,相比于手工移液操作,具有极大的优势:
▪ 提高实验通量(在384孔板中建立PCR反应体系,日检测通量达到20000个/天)
▪ 减少样本和试剂用量从而节约成本(微缩化PCR/qPCR体系至2μL)
▪ 提高流程的标准化和可重复性(减少人为操作带来的实验误差)
▪ 一次性耗材有效降低交叉污染风险(枪头经过除酶灭菌处理)
▪ 工作站体积小巧易于整合(可整合机械臂、大型工作站、层流罩)
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