南京大学医学院附属口腔医院闫福华教授团队的刘佳盈、陈斌等人的研究成果"Macrophage polarization in periodontal ligament stem cells enhanced periodontal regeneration"在学术期刊 STEM CELL RESEARCH & THERAPY上成功发表，海斯菲德公司的Micro CT产品（产品型号：Hiscan XM）在论文中提供了重要的大鼠牙槽骨显微CT重建图像。

 

目的：探究在基于牙周膜干细胞（PDLSC）的牙周再生过程中巨噬细胞是否以及如何参与PDLSC再生过程中的组织稳态和创面愈合。

实验方法：利用大鼠牙周缺损模型观察PDLSC移植增强牙周修复过程中的再生过程。分别于术后第3、7和21天观察M1 / M2巨噬细胞标志物的动态变化，并在第21天分析再生的结果。此外，作者为了进一步研究PDLSCs对巨噬细胞极化的影响，使用PDLSCs的条件培养基处理M0，M1和M2巨噬细胞24小时后同时在巨噬细胞中评估了M1 / M2极化标记。

结果：在第21天，Micro-CT扫描结果显示在PDLSC治疗组中的骨体积和骨小梁的平均厚度增加。同时，经PDLSC治疗的牙周再生增强，同时伴有明显的胶原纤维形成。此外作者还发现PDLSC培养可通过下调TNF-α并上调IL-10，Arg-1和CD163诱导巨噬细胞向抗炎表型极化。

结论：PDLSCs可以诱导巨噬细胞向M2型表型极化，并且在组织修复的早期极化向M2巨噬细胞的转变有助于干细胞移植后牙周再生的增强。因此，来自移植的PDLSC的信号可能会改变免疫微环境，从而增强牙周再生。

 

作者选用了5周龄雄性 Sprague-Dawley (SD)大鼠的第一、二磨牙进行 PDLSC 分离、培养和鉴定。

实验选用了SD大鼠的股骨和胫骨用于分离BMDM。培养分离的细胞时使用补充了10％的FBS，1％的P/S和40 ng/ml巨噬细胞集落刺激因子的DMEM（M-CSF,PeproTech, USA）。在培养开始7天后，用50 ng / ml脂多糖（LPS，Sigma-Aldrich）和30 ng / ml干扰素-γ（IFN-γ, PeproTech, USA）或20 ng / ml 的白细胞介素4刺激BMDM24小时。7天后用50％的PDLSC-CM替换条件组的培养基而对于测试组使用50%的新鲜培养基替换并培养24h。

实验选用了7周龄SD大鼠共42只，随机分为以下3组：空白组，胶原膜组和PDLSCs胶原膜组。对于PDLSCs胶原膜组，在胶原膜(Bio-Gide®, Geistlich, Switzerland)上添加20ul 的PDLSCs悬浮液（10^6 cell/ml）。在大鼠的右侧口腔面皮肤上作前后方向的切口，进入下颌骨，并使用牙钻和大量的盐水使得第一和第二磨牙的牙根暴露形成大约5mm×1.5 mm×0.8 mm的缺损。术后3天和7天，每组随机处死4只。术后21天，每组随机处死6只，取下右下颌骨并用4%多聚甲醛固定以便下一步治疗。

 

作者通过将带有异体PDLSCs的膜材料移植到老鼠的牙周缺损处(图2 A, C)并在手术后的21天通过显微ct重建对实验组进行观察发现，使用PDLSC治疗组有相对更为连续的骨再生现象(图2 b)。作者还发现，使用PDLSC治疗后的小鼠的骨体积和平均骨小梁厚度(TbTh)有显著增加(图2 D, E)。同时组织学切片的HE和Masson染色可以进一步观察到PDLSC组的新生骨几乎完全覆盖了牙周缺损(图2 H)。可以证明牙周再生的关键表现为胶原纤维走向良好并且在牙本质表面有类牙骨质物体生成。而在其他两组中未观察到相似结构。因此作者认为牙骨质再生可能与移植的PDLSCs有关。

 

 

作者在细胞因子分泌和巨噬细胞极化方面检查了PDLSCs是否可能通过牙周愈合影响炎症环境。实验结果显示手术后3天，与其他两组相比，PDLSC组的IL-10水平较高而TNF-α分泌水平较低（图3 A, B)，并且在未来的第7天和第21天TNF-α的水平一直在所有实验组中处于最低水平（图3C-F）。而对于IL-10分泌水平，从3-21天开始PDLSC组逐渐趋于稳定，同时在空白和膜组中IL-10分泌水平一直在增加。因此，在愈合的后期，PDLSC组中的IL-10在第21天时低于其他组（图3A-F）。因此就总体而言，它在体内发挥了抗炎功能。

 

 

作者进一步研究了PDLSC对体外巨噬细胞亚群的影响。图4A显示被LPS和IFN-γ刺激的巨噬细胞呈扁平圆形，而用IL-4处理的巨噬细胞则较长。通过图4B和C可以观察到M(LPS+IFN-γ)表达了高水平的iNOS、TNF-α和低水平的Arg-1。相反，经IL-4处理的巨噬细胞表现出高水平的Arg-1和低水平的iNOS、TNF-α，这与未活化的巨噬细胞相似。该结果与 LPS +IFN-γ或IL-4等不同刺激处理的巨噬细胞的特征与相关研究的报道一致。

 

 

作者为了研究PDLSC对巨噬细胞的影响，使用PDLSC条件培养基治疗未活化和极化的巨噬细胞。实验检测到M2或抗炎巨噬细胞的表面标记物CD163。图5AB显示经过PDLSC-CM处理24小时后，未激活的巨噬细胞和M（IL-4）的CD163 +巨噬细胞比例均增加。图5CD显示通过PDLSC条件培养基培养后，CD163+巨噬细胞比例在48小时有明显增长。然而，在PDLSC-CM处理24小时或48小时后，未发现M上CD163表达的显着变化（LPS +IFN-γ）。因此结果表明，PDLSC通过其旁分泌产物诱导CD163在非活化和抗炎巨噬细胞中的表达，而对促炎巨噬细胞没有显着影响。

 

 

作者为了进一步探索PDLSC对巨噬细胞的作用，定量了TNF-α，IL-10，Arg-1和iNOS的基因转录。如图6所示PDLSC-CM降低了TNF-αmRNA转录，同时增加M（-）和M（IL-4）中的IL-10，Arg-1和iNOS转录。PDLSC-CM增加了M（LPS +IFN-γ）中iNOS的转录，但没有改变TNF-α，IL-10和Arg-1转录。如此表明，来自PDLSCs的旁分泌产物通过下调TNF-α并上调IL-10和Arg-1对未活化和消炎的巨噬细胞发挥抗炎作用。

 

 

综上所述，作者的研究表明 PDLSC 移植可能通过影响巨噬细胞向 M2 亚型的极化而促进再生。但是PDLSCs 对巨噬细胞极化的作用机制及其对牙周微环境的免疫调节仍需要进一步研究。牙周创面愈合是一个复杂的过程，涉及多种分子和细胞类型相互作用，在局部环境中完成再生过程。此论文对有关该流程的信息研究有限，指出了可能参与该流程的几个相关成分，巨噬细胞对牙周再生的直接作用以及背后的机制仍需要进一步的研究来证实。基于免疫干预结合 PDLSCs 或其产品的新方法在牙周再生中的疗效有待研究。

 

Hiscan XM Micro-CT System是一款集离体扫描和活体扫描于一体的Micro-CT。最高分辨率可达4µm。最大扫描范围可达到75mmx210mm(多次扫描)。可做小动物全身扫描，如小鼠、大鼠等；也可以扫描所选择的感兴趣区域，例如小鼠和大鼠的头部、脊椎、前肢、后肢等；还可以扫描离体样本材料，如小鼠或大鼠的股骨、胫骨、颅骨、牙齿、四肢，生物支架材料，电子元器件，建筑材料，植物土壤，植物种子，昆虫等各种需要扫描其内部结构的材料。

 

 

[1] Liu, Jiaying & Chen, Bin & Bao, Jun & Zhang, Yangheng & Lei, Lang & Yan, Fuhua. (2019). Macrophage polarization in periodontal ligament stem cells enhanced periodontal regeneration. Stem Cell Research & Therapy. 10. 320. 10.1186/s13287-019-1409-4.