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避免抗体选择“灾难”,教你如何正确选择抗体!

2022-01-17     来源:本站     点击次数:170

很多生物学实验都需要使用抗体,例如WB、IHC、IF、FC等等,不同的实验对于抗体的选择是有差异的,如果抗体选择不合理,那么实验的结果将很难达到理想效果。那么如何选择抗体呢?来了解一下吧。

01.搜索抗体信息

将需要检测的抗原名称输入到抗体供应商的网站(如阿abcam、santa cruz)中,可以得到一系列搜索结果,如图以IL6为例: 

02.  根据实验需要选择合适的抗体

(1)WB

WB最好的抗体是采用非常特异序列的人工合成多肽的方法来做实验,结果也非常特异。

(2) IF/IHC

免疫荧光和免疫组化中需要进行固定,固定使蛋白质变性凝固,与天然状态下的蛋白质有了一定的区别,但不同于WB中加热变性变成了线性的结构。因此在做IF/IHC实验中,最合适的抗体可以是纯化的重组蛋白得到的抗体,也可以是人工合成多肽得到的抗体。

(3)FC

流式细胞中分为两种,一种是活细胞的流式,这种流失最好采用是天然蛋白或者重组蛋白的抗体来做,另外一种是经过固定之后的流式,和IF/IHC 所用抗体一致。 

03.根据物种选择抗体

应选择物种相同或有交叉反应的抗体,抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应,因其氨基酸序列同源性较高,如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中,并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白,而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过,应通过序列比对的方法来预测交叉反应,可应用Expasy 和 NCBI BLAST 来进行不同物种蛋白同源性比对。

一般说来,在使用偶联二抗结合无偶联物的一抗时,一抗宿主动物的物种选择较为重要,对于免疫组化而言,尽可能选择与样本不同种系物种的一抗,从而避免二抗与样本内源性免疫球蛋白产生交叉反应,例如:检测小鼠样本蛋白,则不应选择小鼠或大鼠源的一抗,最好选兔源的一抗,则二抗则可选择偶联了检测分子(酶、荧光素、生物素等)的抗兔IgG。

04. 荧光和化学发光标记

连接于二抗的标记物是为了检测抗体的结合,选择抗体时也应该进行考虑。

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