Elispot（酶联免疫斑点检测）样本制备介绍
2025-05-30 来源:本站 点击次数:71Elispot（酶联免疫斑点检测）是一种高灵敏度的技术，用以检测单个细胞分泌的细胞因子或其它生物分子。Elispot技术作为疫苗研究免疫原性验证的金标准，其中单核免疫细胞的质量对实验结果起着决定性的作用。因此单核免疫细胞的制备流程中一些可能影响细胞活率和功能的细节需要特别注意。
目前常见的样本类型包括人的外周血单核细胞（PBMC）、动物脾脏提取单核细胞以及肿瘤浸润淋巴细胞等。Elispot实验对于细胞的活率要求较高，通常在90%以上的活率，能保证准确的结果，有些样本受限不能拿到高活率的，则可将细胞活率降至80%。我司对于人外周血以及小鼠脾脏组织提取单核细胞实测数据如下：
表1:不同样本类型的细胞活率比较
二、PBMC细胞提取注意事项
1. 人外周血离体后，放入抗凝剂的管子中，推荐使用肝素钠，不建议使用EDTA，同时放置在室温中，不要放置在低温环境中，否则会影响细胞提取的活率，放置时间不要超过8小时。2. 细胞脾脏组织需要新鲜分离的脾脏，禁止冻存，同时将脾脏组织上的脂肪组织去除干净，研磨制备单细胞悬液的过程要尽量迅速，尽量在5分钟内完成，离心前的所有操作。3. 所有用以提取分离单核淋巴细胞的试剂均应提前置于室温平衡。4. 离心机温度设置为25℃，切勿设置低温！5. 密度梯度离心的第一步离心，降速和升速制动均设置为2或以下。6. 使用冻存的细胞来进行实验时，需提前复苏细胞，然后在细胞培养箱里至少静置1小时，再用来进行后续实验。7. 细胞冻存时使用含10%DMSO/90%血清的冻存液，使用程序降温盒逐步降温，后置于液氮罐中保存。短期如3天内可放置于-80℃冰箱保存。长期保存则放置于液氮罐中。8. PBMC细胞制备过程中，需要将红细胞去除干净，若分离过程中仍有红细胞存在可考虑使用裂红的方法去除。
表2. 不同冻存温度下pbmc细胞活率
1.细胞活率方面超低温运输（-196℃）结果明显优于低温运输（-80℃），但在T细胞活率方面两者无明显差别。
2.将不同温度条件下寄送的PBMC样本复苏后，进行Elispot实验，都分别使用两种不同的抗原进行免疫刺激，然后比较不同运输条件下对抗原的相应差异，结果表明超低温运输条件下有更好的抗原免疫反应。
1. 背景信号升高死细胞会释放蛋白酶，核酸酶等物质，可能降解包被抗体或捕获的细胞因子，导致非特异性结合或者背景斑点增加。
2. 有效细胞数量减少细胞活率低，功能性细胞数目不足，可能导致斑点数量减少，甚至出现假阴性结果。
3. 细胞功能受损CD4+T细胞尤其是DC细胞功能受限，导致分泌细胞因子的功能受损。
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