布氏锥虫简介：布氏锥虫是一种鞭毛寄生虫，能够导致布氏锥虫病，可以在人和动物体内进行寄生，引起人的嗜睡症和家畜的那加那病。

摘要

锥虫生命周期中的发育步骤涉及了复制型和非复制型之间的转变，该转变专门用于哺乳动物和舌蝇宿主之间的生存和传播。在这里，我们利用寡肽诱导的体外分化，模拟了从复制的“细长型“到可传播的“短粗型”锥虫的渐进发展，并利用单细胞转录组测序（scRNA-seq），捕获了8599种寄生虫的转录组。利用这个框架，我们详细描述了异步发育过程中生物事件的相对顺序，分析了动态基因表达模式，并确定了可能的调控因子。此外，我们还绘制了增殖寄生虫的细胞周期图，并将短粗型细胞周期退出的时间定位在发展到一个不同的G0状态之前的G1早期。利用scRNA-seq进一步分析瞬时升高的发育调节因子ZC3H20的无义突变体，确定了其在发育图谱中的失败节点。寄生虫分化与病原体生物学的不同转变相关，这种方法为剖析寄生虫分化事件提供了一个范例。
 

研究结果

Result1：scRNA-seq区分细长型和短粗型的转录组

为了在体外得到短粗型的锥虫，作者用富含寡肽的10%的BHI处理细长型锥虫，同时，检测0h、24h、48h、72h时锥虫的数量、锥虫形态、含有短粗型maker蛋白PAD1的锥虫数量、细胞核的拷贝数以及动质体DNA，结果发现，72h以后，锥虫生长停滞、形态改变且短粗型锥虫数量发生了增长。

接着，为了捕获细长型、中间型以及短粗型的寄生虫，作者将0h、24h、48h、72h的锥虫等比例混合，利用Chromium Single Cell 3′ workflow和Illumina两个平台得到锥虫的转录组数据，总共做了2个重复：WT1、WT2，分别得到了5321和3278个单细胞。然后，作者将WT1和WT2的数据整合了到一起，进行了聚类分析，得到了4个cluster，分别命名为Slender A(SLA)、Slender A(SLB)、Stumpy A (SSA)、Stumpy B (SSB)，分析发现它们之间存在516个差异表达的基因，作者还利用GO富集，分析了每个cluster的Maker基因与各个生物事件的关联。

Fig.1体外血液型分化过程中单个布氏锥虫的转录组测序

Result2：细长型分化为短粗型锥虫的轨迹分析

作者利用PHATE，鉴定了一个从SLA细胞到SSB细胞的线性发育轨迹，并且，细长型锥虫和短粗型锥虫的Maker基因在轨迹上的表达也证实了从细长型到短粗型的转变。除此之外，作者鉴定出伪时间作用下的1791个基因，根据表达模式，将这些基因分为了9个模块，对9个模块进行GO分析，作者得到了锥虫从细长型到短粗型转变过程中的生物事件的相对顺序。

Fig.2 伪时间分析揭示了细长到短粗分化过程中基因的动态表达

Result3：布氏锥虫在G1期早期退出细胞周期

为了分析锥虫退出细胞周期的时间以及短粗型锥虫转录本的表达情况，作者利用Bulk RNA-seq得到的Maker基因，将每个细胞匹配到了其相对应的细胞周期。作者发现，SLA里有94.1%的锥虫表达cell-cycle maker基因，而SLB里46.6%的锥虫被标记为non-cycling，并且，这些non-cycling的细长型锥虫最接近于短粗型锥虫。接着，作者对SLA以及SLB进行分群和再定位，分析其发育轨迹，他们发现在发育轨迹末端，大多数的细胞处于G1早期或者为non-cycling细胞，这些结果表明，在血液锥虫分化的过程中，大多数细胞在G1早期退出细胞周期。

Fig.3 分化的布氏锥虫在G1早期退出细胞周期

Result4：转录物丰度在细长型锥虫的细胞周期中发生变化

作者去掉SLA以及SLB里non-cycling细胞，并对剩余的细胞进行UMAP作图，结果发现这些细胞刚好按照细胞周期的顺序形成了一个清晰的环。为了分析锥虫在细胞周期过程中的基因表达变化，作者将发育轨迹拟合到UMAP图上，并赋予伪时间值，对每个与伪时间相关的基因表达活性进行鉴定发现，有884个基因显著性差异表达，还通过GO富集分析得到了几个蛋白水平或者分布与scRNA-seq预测的细胞表达时间相匹配的基因。

Fig.4 鉴定细长型细胞周期中差异表达的基因

Result5：ZC3H20无义锥虫不能在体外进行分化

作者将ZC3H20 KO锥虫在10%BHI培养72h以后发现，它们不能正常地向短粗型锥虫分化。接着，他们将ZC3H20 KO在10%BHI中进行0h、24h、48h以及72h的培养，并取各个时期的锥虫进行sc-RNA seq，对得到的数据以及WT的数据进行聚类分析，结果显示存在stumpy A、stumpy B、 slender A.1、slender A.2、slender B.1、slender B.2共6个cluster，其中，ZC3H20 KO在短粗型cluster中的细胞只占自身细胞的0.13%，大部分的细胞都为细长型锥虫。

Fig.5 不能分化的ZC3H20 KO布氏锥虫的scRNA-seq分析

Result6：转录下调和上调独立发生

WT和ZC3H2 KO锥虫的发育轨迹存在分支，在发育早期，两者的轨迹一致，但是到了后期，WT以短粗型锥虫结尾，而ZC3H2 ko则以slender B.2结尾，为了分析这种变化，作者评估了WT中与分化相关基因的表达，并将这些基因mapping到轨迹上，结果发现，当ZC3H20 KO受到BHI分化刺激时，下调了与细长型细胞相关的转录本，然而，在发育后期，却不能够上调短粗型锥虫相关的转录物，这一失调的点与正常WT分化期间ZC3H20表达的峰值一致。

Fig.6  WT细胞和不能分化的ZC3H20 KO细胞在分化过程中差异表达基因的比较

Fig.7 血液锥虫从细长到短粗转变的模型