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谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性测定试剂盒食用说明书

2022-05-16     来源:本站     点击次数:335

谷氨酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性测定试剂盒说明书
分光光度法 50 管/48 样
 
注意: 正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
 
测定意义:
GLS(EC 3.5.1.1)是酰胺基水解酶,催化天冬酰胺水解成谷氨酸和氨,在氮素代谢中具有重要调控作用,尤其是调节游离氨含量和尿素代谢。
 
测定原理:GLS 催化谷氨酰胺水解成 L-谷氨酸和氨,利用奈氏试剂检测氨增加的速率,即可计算其酶活性。
 
需自备仪器和用品:
台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制:
试剂一×1 瓶,60 mL,4 ℃保存;
试剂二×1 瓶,20 mL,4 ℃保存;
试剂三×1 瓶,30 mL,常温保存;
试剂四×1 瓶,10 mL,常温保存;
试剂五×1 瓶,6 mL,常温保存;
试剂六×1瓶,6 mL,常温避光保存。

粗酶液提取:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量
104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一),超声波
破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);
8000g4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(
g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,
加入 1mL 试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 420nm,蒸馏水调零。
2、样品测定(在 EP 中加入下列试剂):
试剂名称(uL)
测定管        对照管
样本 25       蒸馏水 25
试剂一100 100
试剂二400 400
混匀,37℃水浴 1 小时
试剂三525 525混匀,8000 g,25℃离心 10 min;取上清液,在 EP 管中加入下列试剂
上清液  650 650
试剂四 150 150
试剂五 100  100
试剂六  100 100
混匀,室温静置 15min,420nm 处读取吸光值 A,计算ΔA=A 测定管-A 对照管。对照管只要做一管。

注意:
1、试剂六如出现沉淀,静置后取上清使用。
2、ΔA(A 测定管-A 对照管)若出现负值,可能是酶活性较低,可将反应时间 1h 延长到 2h,相应的在计算
公式中除以 2。
酶活性计算:
标准条件下测定的回归方程为 y =3.8488x +0.0057,R2 = 0.9983;;x 为标准品浓度(μmol/mL),y 为吸光值 A。
1、血清(浆)GLS 活性
单位定义:每 mL 血清(浆)每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。GLS(
nmol /min /mL)= (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反总÷V 样÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)
2、组织、细菌或细胞 GLS 活性
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每 mg 蛋白质每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
GLS(nmol /min /mg prot)= (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)÷Cpr
(2)按样本鲜重计算:
单位定义:每 g 组织每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。
GLS(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0057)÷3.8488×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算
单位定义:每 1 万个细菌或细胞每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。GLS
(nmol/min/104 cell)=(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反总÷(500× V 样÷V 样总)÷T×1000
=0.3637×(ΔA-0.0057)V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,60min;V 反总:反应体系总体积,1.05mL;V 样:加入反应体系中样本体积,0.025mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万; 1000,μmol 到 nmol 换算系数。
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