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β-木糖苷酶(β- xylosidase)测定试剂盒使用说明书

2022-05-18     来源:本站     点击次数:351

β-木糖苷酶(β- xylosidase)测定试剂盒说明书
微量法100T/48S
 
    正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:
β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)存在于植物、细菌和真菌等生物体,是催化木聚糖类半纤维素降解的关键酶,产物木糖可作为碳源应用于微生物发酵。另外,β-木糖苷酶还可以作为生物漂白剂应用于造纸工业,比传统的漂白法环保,具有广泛的应用价值。
 
测定原理:
β-木糖苷酶催化对硝基苯酚-β-D-木糖苷产生对硝基苯酚,对硝基苯酚在405nm处有特征吸收峰,测定405nm光吸收增加速率,可计算β-木糖苷酶活性。
 
自备实验用品及仪器:
天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。
 
试剂组成和配制:
提取液:液体100mL×1瓶,4℃保存。
试剂一:液体1mL×1瓶,4℃避光保存。
试剂二:液体10mL×1瓶,4℃保存。
试剂三:液体10mL×1瓶,4℃保存。
 
粗酶液提取:
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后10000g,4℃,离心20min,取上清待测。
细菌、真菌:按照细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后10000g,4℃,离心10min,取上清置于冰上待测。
液体:直接检测。
 
测定操作表:
  • 分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长至405nm。
  • 操作表
  对照管 测定管
酶液(μL) 40 40
试剂一(μL)   10
试剂二(μL) 80 70
混匀,45℃水浴20min
试剂三(μL)  80 80
混匀,静置5min,405nm处测定吸光值A,计算ΔA=A测定管-A对照管。每个测定管设一个对照管。
 
β-木糖苷酶活性计算公式:
  • 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y=13.226x+0.0011,R2=0.9998;x为标准品浓度(μmol/mL),y为吸光值ΔA。
1、按蛋白浓度计算
酶活定义:45℃,pH7.4时每毫克蛋白1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性(nmol/min/ mg prot)=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反总÷(V样×Cpr)÷T×1000
                            = 11.34×(ΔA -0.0011)÷ Cpr
2、按样本质量计算:
酶活定义:45℃,pH7.4时每克样品1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反总÷(V样÷V样总×W÷T×1000= 11.34×(ΔA-0.0011)÷W
3. 按细胞数量计算:
酶活定义:45℃,pH7.4时每104个细胞1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反总÷V样×V样总÷细胞数量(万个)÷T×1000=11.34×(ΔA-0.0011) ÷ 细胞数量(万个)
4. 按液体体积计算
酶活定义:45℃,pH7.4时每毫升液体1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性(nmol/min/ mL)=(ΔA-0.0011) ÷13.226×V反总÷V样÷T×1000=11.34×(ΔA-0.0011)
V样总:加入提取液体积,1mL; V反总:反应总体积,0.12mL;V样:反应中样品体积,0.04mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样品质量,g;T:反应时间,20min;1000:1μmol/L=1000nmol/L
  • 用96孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y=6.613x+0.0011,R2=0.9998;x为标准品浓度(μmol/mL),y为吸光值ΔA
1、按蛋白浓度计算
酶活定义:45℃,pH7.4时每毫克蛋白1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性(nmol/min/ mg prot)=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反总÷(V样×Cpr)÷T×1000= 22.68×(ΔA -0.0011)÷ Cpr
2、按样本质量计算:
酶活定义:45℃,pH7.4时每克样品1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T×1000= 22.68×(ΔA-0.0011)÷W
3. 按细胞数量计算:
酶活定义:45℃,pH7.4时每104个细胞1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性(nmol/min/104cell)=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反总÷V样×V样总÷细胞数量(万个)÷T×1000=22.68×(ΔA-0.0011) ÷ 细胞数量(万个)
4. 按液体体积计算
酶活定义:45℃,pH7.4时每毫升液体1min内催化产生1 nmol对硝基苯酚为一个酶活单位。
β-木糖苷酶活性(nmol/min/ mL)=(ΔA-0.0011) ÷6.613×V反总÷V样÷T×1000=22.68×(ΔA-0.0011)
V样总:加入提取液体积,1mL; V反总:反应总体积,0.12mL;V样:反应中样品体积,0.04mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样品质量,g;T:反应时间,20min;1000:1μmol/mL=1000nmol/mL
ΔA控制在0.01-1范围内,若ΔA大于1,可适当减小样本量。
标准曲线线性范围为:0.01μmol/mL-0.5μmol/mL
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