血液组成及血液基因组提取方法的介绍
2022-05-19 来源:本站 点击次数:3342背景：
随着分子生物学技术的发展，基因组学研究已成为热点。在分子遗传学和分子流行病学中，无论是全基因组关联分析GWAS（Genome-Wide Association Studies）、候选SNP（Single Nucleotide Polymorphism）位点基因分型，还是基因组文库的建立，都需要从大批量血液样本中提取基因组DNA。因此，如何能够从高通量血液样本中提取足量的高质量、高纯度DNA便成为下游实验的基本前提。
为了提取获得高质量、高纯度血液基因组DNA，首先让我们需要了解一下血液的组成。
图源：
https://www.khanacademy.org/science/biology/humanbiology/circulatorypulmonary/a/components-of-the-blood
1.血液的组成
血液是动物体内的一种体液，可向细胞输送必要的物质，如营养和氧气，并将代谢废物从这些细胞中运走。血液的主要组成包括：血浆（液体部分，含有水、蛋白质、盐、脂质和葡萄糖）、红细胞、白细胞和血小板。
https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/
人体血液的细胞和细胞成分：红细胞向细胞输送氧气并去除二氧化碳。白细胞（包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞）参与免疫反应。血小板形成凝块，防止受伤后失血。
a.血浆：
血浆是去除所有细胞和血小板后的血液液体成分，约占总血量的 55%。血浆由 90% 的水和抗体、凝血因子以及维持身体所需的电解质、脂质和蛋白质组成。
b.红细胞：
红细胞（Red blood cells或erythrocytes，erythro- = “红色”；-cyte = “细胞”）是一种通过身体循环向其他细胞输送氧气的特殊细胞，由骨髓中的干细胞形成，约占总血量的 45%。在哺乳动物中，红细胞是小的双凹细胞，成熟时不含细胞核或线粒体。它们的大小只有 7–8 µm。在鸟类和非鸟类爬行动物中，红细胞含有一个细胞核。
红细胞的颜色来自含铁血红蛋白，在大多数哺乳动物中，红细胞没有任何细胞器（例如细胞核、线粒体）。无脊椎动物使用不同的色素来结合和携带氧气。例如血蓝蛋白（一种蓝绿色、含铜的蛋白质）、氯红素（一种绿色、含铁的色素）和蚯蚓血红蛋白（一种红色、含铁的蛋白质）。
图源：
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a.血红蛋白 b. 血蓝蛋白 c. 蚯蚓血红蛋白
c.白细胞：
白细胞（White blood cells或 leukocytes，leuko = 白色）约占总血量不到 1%。白细胞的作用与红细胞的作用非常不同。它们主要参与识别和靶向病原体的免疫反应，例如入侵的细菌、病毒和其他外来生物。
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白细胞的类型：(a) 粒性细胞（中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞）的特征在于细胞质中的叶状核和粒状包涵体。粒细胞通常是受伤或感染期间的第一反应者。(b) 无粒细胞包括单核细胞和淋巴细胞。单核细胞分化成巨噬细胞和树突状细胞，进而对感染或损伤作出反应。淋巴细胞，包括 B 细胞和 T 细胞，负责适应性免疫反应。
d.血小板：
血小板是由称为巨核细胞的较大细胞分解形成的。对于每个巨核细胞，形成 2000-3000 个血小板，每立方毫米血液中存在 150,000 至 400,000 个血小板。每个血小板呈圆盘状，直径为 2-4 μm，它们包含许多小囊泡，但不包含细胞核。
(a) 血小板是由称为巨核细胞的大细胞形成的。巨核细胞分裂成数千个碎片，成为血小板。(b) 血小板与其他凝血因子（例如纤维蛋白原）一起聚集在伤口部位，形成纤维蛋白凝块，防止失血并使伤口愈合。
2.血液基因组提取方法
a.盐析方法:
经典盐析法提取血液DNA，其方法为溶解红细胞后，离心沉渣用PK消化，用大约6M饱和NaCl沉淀蛋白质，离心上清中DNA用无水乙醇沉淀，用TE溶解。此方法提取的DNA质量尚可，但产率较低，并且纯度较差。
b.有机溶剂方法:
有机法提取DNA一般是指用平衡酚(又叫饱和酚)、氯仿等按不同比例混合，采用不同方法提取DNA。此方法操作繁琐，耗时久，且所用试剂具有一定的毒性。
c.柱法（硅膜法）：
特殊硅基质材料在一定的高盐缓冲系统下高效、专一地吸附DNA（低盐、高pH值情况下释放DNA），配备设计独特的离心吸附柱式结构，使用常规台式高速离心机，在30-60min之内即可以高效回收核酸片段。此方法操作简便，但依赖人工操作，很难实现自动化。
d.磁珠法：
异硫氰酸胍是强烈蛋白变性剂，不破坏蛋白质一级结构，能破坏细胞膜及核膜蛋白，并使核酸酶失活，释放DNA。磁珠可以特异性吸附DNA，通过洗涤液洗涤，在仅留有特异吸附DNA的磁珠中加入洗脱液，DNA释放于洗脱液中。此方法自动化程度高，可满足高通量提取的需求，是未来核酸提取的发展方向。
3.济凡磁珠法大体积血液核酸提取
近些年，随着医院和第三方独立医学实验室等医疗机构建立DNA样本库的需求越来越广泛，1～4mL大体积全血DNA提取的工作量迅速增加，传统的手动操作方案已经不能满足建立大量血液DNA样本库的要求，可实现大体积全血DNA的高通量快速自动提取的工作站已经成为大势所趋。
目前市面上大体积全血样本DNA提取产品多采用裂解红细胞前处理+离心吸附柱方法从全血样本中分离纯化DNA，但此方法存在操作繁琐、通量小和耗时长的不足。由济凡生物研发的新型血液核酸提取试剂，搭配24通道自动核酸提取仪可实现大体积血液样本核酸分离纯化。新方案无红细胞裂解前处理，只需将血液样本加入装有裂解液的24孔预分装板后，交由24通道自动核酸提取仪去完成；本方案一次可提取24个样本，整个过程在2小时内便可完成。
示例：济凡磁珠法大体积血液样本DNA分离纯化方案，提取2 mL全血样本（300 μL 洗脱）
由图示结果可知：济凡磁珠法大体积血液DNA分离纯化方案提取2 mL全血样本基因组DNA，DNA得率为70~78 μg，A260/A280比值为1.8~2.0，A260/A230比值为1.8~2.0。
参考文献：
1.Components of the Blood
https://courses.lumenlearning.com/boundless-biology/chapter/components-of-the-blood/
2.Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988 Feb 11;16(3):1215. doi: 10.1093/nar/16.3.1215. PMID: 3344216; PMCID: PMC334765.
3.Buedts L, Smits S, Ameye G, Lehnert S, Ding J, Delforge M, Vermeesch J, Boeckx N, Tousseyn T, Michaux L, Vandenberghe P, Dewaele B. Ultra-low depth sequencing of plasma cell DNA for the detection of copy number aberrations in multiple myeloma. Genes Chromosomes Cancer. 2020 Aug;59(8):465-471. doi: 10.1002/gcc.22848. Epub 2020 May 5. PMID: 32259320.