在生物医学研究和药物开发领域，多肽合成是一项关键技术。随着自动化技术的发展，多肽合成仪的应用越来越广泛，为科研人员提供了高效、精确的解决方案。

自动化多肽合成的重要性
多肽在药物研发、生物医学研究等领域有着广泛的应用。例如，在药物研发中，多肽类药物具有高特异性和低毒性的特点，成为治疗多种疾病的候选药物。然而，传统的手动合成方法不仅耗时耗力，而且容易出错，难以满足现代科研的需求。自动化多肽合成仪的出现，大大提高了合成效率和纯度，为科研人员提供了更可靠的工具。

自动化多肽合成的基本原理
自动化多肽合成基于固相合成（SPPS）技术，该技术由 Bruce Merrifield 于 1963 年发明。其核心思想是将肽链的 C 端固定在固相载体（树脂）上，通过逐步添加氨基酸来延长肽链。每一步反应包括脱保护、偶联和洗涤，这些步骤可以精确控制和监控。

在 SPPS 中，常用的保护基是 Fmoc（9 - 芴甲氧羰基），它可以在温和的条件下脱除，而侧链保护基则在最后一步同时脱除。自动化合成仪通过精确控制试剂的添加和反应时间，确保每一步反应的高效进行，从而提高产率和纯度。
 

• 流体处理系统：确保试剂和溶剂的精确输送，避免交叉污染。现代微流体系统如PTI全自动多肽合成仪的 Pure Pathway 采用独立通道和精确控制技术，保证了反应的一致性。
• 反应容器配置：根据合成规模和树脂特性选择合适的反应容器，确保树脂充分溶胀和试剂有效混合。
• 温度控制系统：温度对反应速率和副反应有显著影响，精确的温度控制可以优化反应条件。
• 实时监测功能：通过 UV 监测等技术实时跟踪反应进程，及时调整脱保护和偶联步骤，确保反应效率。
• 软件系统：现代合成软件不仅控制硬件，还能设计合成方法、监控参数并记录数据，支持复杂项目的管理和合规性要求。

图 2 PurePpe Chorus全自动多肽合成仪电磁感应加热示意图
 

图 3 PurePep Chorus全自动多肽合成仪矩阵式液体传输通路示意图
 

图 4 PurePep Chorus全自动多肽合成仪软件实时UV监测界面

设计合成的步骤
设计一个高效的多肽合成方案需要考虑多个因素，包括起始材料的选择、脱保护和偶联条件的优化等。

选择起始材料

• 树脂选择：树脂是固相合成的基础，其核心材料（如聚苯乙烯、PEG-PS）和连接子决定了树脂的溶胀性、疏水性和最终肽链的 C 端结构。例如，Rink Amide 树脂适合合成酰胺化 C 端的肽，而 Wang 树脂适合合成羧酸 C 端的肽。
• 保护基选择：Fmoc 保护基用于 α- 氨基的保护，侧链保护基则根据氨基酸的不同选择合适的基团，如 Pbf 保护精氨酸，tBu 保护丝氨酸等。
• 合成规模：根据目标肽的需求确定合成规模，通常从 20-50μmol 开始，逐步优化条件。

优化脱保护条件
脱保护是 SPPS 中的关键步骤，直接影响反应效率和副反应的发生。常用的脱保护试剂是哌啶（piperidine），但高温可能导致副反应如 Aspartimide 的形成。优化脱保护条件包括：

• 温度控制：对于容易形成 Aspartimide 的序列（如含 Asp 的序列），应避免高温，可选择室温或 50°C 进行脱保护。
• 重复次数和时间：通过 UV 监测确定脱保护的效率，调整哌啶处理的重复次数和时间，确保 Fmoc 完全脱除。

优化偶联条件
偶联反应的效率直接影响肽链的延伸和最终纯度。优化策略包括：

• 试剂过量：使用过量的氨基酸（通常 5-7.5 倍当量）和活化剂（如 HCTU、DIC/Oxyma），以推动反应向右进行。
• 反应时间和温度：根据偶联化学的不同，调整反应时间和温度。例如，HCTU/DIPEA 在室温下需要 15-30 分钟，而 DIC/Oxyma 在 90°C 下可缩短至 2 分钟。
• 加热辅助：对于困难偶联，加热可以加速反应，但需注意温度对序列的影响。

常见问题及解决方法
在自动化多肽合成过程中，可能会遇到一些常见问题，以下是一些解决方法：

• Aspartimide 形成：当肽链中含有 Asp 时，重复的碱性条件（如哌啶处理）可能导致 Aspartimide 的形成，影响纯度。解决方法包括降低脱保护温度、使用弱碱（如添加 HOBt 或甲酸）或更换保护基。
• 树脂选择不当：选择不合适的树脂可能导致溶胀不足或副反应增加。根据肽链的特性（如长度、疏水性）选择合适的树脂和连接子。
• 溶剂优化：传统溶剂如 DMF 可能对环境和健康有影响，研究表明 DMSO 和乳酸乙酯等绿色溶剂在特定条件下可以替代 DMF，减少污染。

优化策略

• 使用序列预测工具：如 Peptide Companion，预测序列中的困难区域（如 β- 分支氨基酸、疏水性区域），提前调整反应条件。
• 实时监测和反馈：通过 UV 监测实时跟踪脱保护和偶联的效率，自动调整反应时间和重复次数。
• 分步优化：对于长肽或复杂序列，分步合成并优化每一步的条件，确保整体反应的高效进行。
• 组合不同偶联化学：根据不同氨基酸的特性，选择合适的偶联化学，提高反应效率。

图 5 PTI多肽合成仪肽合成预测软件界面

案例研究：ACP 肽的合成优化
为了更好地理解自动化多肽合成的优化过程，我们以 ACP 肽（氨基酸 64-75 片段）为例进行说明。ACP 肽由于其序列中包含 β- 分支氨基酸（缬氨酸、异亮氨酸）和芳香族氨基酸（酪氨酸），被认为是一个具有挑战性的合成目标。

初始条件

• 树脂：Rink Amide 树脂（高负载）
• 脱保护：室温，2 次，每次 5 分钟
• 偶联：HCTU/DIPEA，7.5 倍当量，2 次，每次 1 分钟

结果分析
初始条件下，ACP 肽的粗纯度达到 92%，但高负载树脂的使用导致试剂消耗较大。为了优化试剂使用，尝试将当量降低至 5 倍，同时保持偶联时间为 2 次，每次 1 分钟。结果粗纯度降至 66%，并出现了缬氨酸缺失的情况。

优化步骤

• 延长偶联时间：将偶联时间延长至 2 次，每次 5 分钟，粗纯度提高至 84%，但仍存在缬氨酸缺失。
• 加热辅助：在偶联步骤中引入加热（如 50°C），进一步提高反应效率，粗纯度可恢复至 92%。
• 更换偶联化学：使用 DIC/Oxyma 在 90°C 下进行偶联，反应时间缩短至 1 次，每次 2 分钟，粗纯度仍保持在 92%。

图 6 利用PurePep Chorus全自动多肽合成仪合成ACP粗肽结果

经验总结
通过调整试剂当量、反应时间和温度，以及选择合适的偶联化学，可以在保证粗纯度的同时优化试剂消耗和反应时间。对于困难序列，加热辅助和分步优化是有效的策略。

自动化多肽合成的未来趋势
随着技术的不断发展，自动化多肽合成领域也在不断创新。以下是一些未来的发展趋势：

• 绿色化学：开发更环保的溶剂和试剂，减少对环境的影响。例如，使用 DMSO 和乳酸乙酯替代 DMF。
• 智能化系统：通过人工智能和机器学习优化反应条件，预测合成结果，提高合成效率。
• 高通量合成：实现同时合成多个不同的肽，满足大规模筛选的需求。
• 新型树脂和连接子：开发更高效、更具选择性的树脂和连接子，拓宽合成范围。

总结
自动化多肽合成仪为科研人员提供了高效、精确的解决方案，从基础原理到优化策略，都需要深入理解和实践。通过合理选择起始材料、优化反应条件和实时监测，可以显著提高多肽合成的产率和纯度。未来，随着技术的不断发展，自动化多肽合成将在更多领域发挥重要作用，推动生物医学研究和药物开发的进步。

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