非洲猪瘟病毒核酸提取操作中需要关注的细节
2022-06-23 来源:济凡生物公众号 点击次数:3543非洲猪瘟病毒简介：
非洲猪瘟病毒属于一类特殊的DNA病毒-核质大DNA病毒（nucleocytoplasmic large DNA virus ，NCLDV)。整个病毒的直径达到260-300nm, 相当于730个甲肝病毒，140个ZIKA病毒，10个HSV疱疹病毒。
非洲猪瘟主要经过口或鼻腔直接接触，或由于接触污染的媒介物（受感染猪的组织、血液、排泄物和分泌物）而发病。病毒通过涉及动力蛋白和网格蛋白介导的内吞作用和巨胞饮作用的复杂过程进入宿主细胞。病毒感染机体后，病毒感染途径从猪的扁桃体和下颌淋巴结中的单核巨噬细胞开始，随着淋巴液和血液进入循环系统，对毛细血管、动脉、静脉和淋巴结的内皮细胞进行侵袭，导致相应组织、器官出现出血、浆液性渗出、血栓和梗死等病理变化，继而造成全身性的出血病变。
非洲猪瘟病毒核酸提取纯化:
由于非瘟病毒传播能力强、致病率高、致死率强、病毒复制能力强且很难根除等特点，建议各大有条件的猪场（具备企业自己的实验室）保持一定的ASFV病毒检测能力。虽然定期检测会花费大量的人力、物力和财力，但如果检测出病毒，通常处于早期阶段，避免更大的损失。病毒检测基于不同的原理的方法很多，其中操作简便、灵敏度高且应用较广的的方法即非瘟病毒核酸提取搭配下游荧光定量PCR进行检测，而核酸提取又以操作简便、通量高、节省人力的磁珠法自动化提取为主。成功的核酸提取的决定因素有三个，分别是前处理、试剂和操作流程。
1. 样本类型及前处理
01 血拭子及全血
在病毒排毒阶段，血液中的病毒含量较高，静脉采血应激大且有滴漏发生病毒扩散的风险，所以尾尖拭子采血操作简便，应激小，污染风险低。血拭子作为核酸提取样本类似稀释后的全血样本，由于采样困难，并且血液存在病毒滞后问题，所以血液样本一般不适合早期“拔牙”监测。血液样本可以直接进行提取操作，如样本有凝血结块，可短暂静置或离心，取上清进行核酸提取操作。
02 口鼻拭子
非瘟野毒排毒过程中，口鼻液比血液检出病毒稍早。猪场在野毒“拔牙”中会经常使用口鼻拭子进行病毒检测。
口鼻拭子作为核酸提取样本可能会带有猪源细胞， 所以下游病毒扩增试剂盒可以采用内源性内参非瘟扩增试剂盒，可以监测病毒核酸提取步骤。除此之外，样本也会混有猪口鼻附近的饲料、泥土、粪便等，如果含有此类抑制物较多可能会对核酸提取和扩增造成不同程度的影响。口鼻拭子可以直接进行提取操作，如含杂质过多可短暂静置或离心，取上清进行核酸提取操作。
03 咽拭子
变异的非瘟毒株，在口鼻液中检出率会较低，而此时咽部的扁桃体病毒含量较多，类似于人类采集新冠样本一样，从咽部采样有利于检出病毒。
咽拭子作为核酸提取样本与口鼻拭子样本类似。
04 口腔液
猪口腔液也就是猪唾液，一般采用咬绳或者唾液收集包等方法对猪唾液进行收集。
唾液样本中不仅含有多种酶，而且也会混有泥土、粪便、呕吐物等含抑制物较多的成分，所以从猪唾液样本中提取病毒核酸对核酸的提取效率和纯度要求很高，猪唾液可以直接进行提取操作，如含杂质过多可短暂静置或离心，取上清作为核酸提取的样本。
05 环境样本
非瘟病毒对温度、PH和腐败抵抗力较强。除了从猪身上采集样本外，也需要从猪场和人员流动较大的场所进行环境采样，检测环境样本可以有效的监测猪场病毒感染情况，一般采用生理盐水纱布或者生理盐水拭子对猪舍、门口、生活区、缓冲区、车辆、人员等位置进行采样检测。环境样本经常被作为日常病毒检测，也是猪场复产所必需做的病原检测。
环境样本种类复杂多样，较脏的环境纱布样本会比拭子样本含有更多的抑制物，采集到的样本会含有粪便、泥土、饲料、灰尘等一系列含腐殖酸的成分，所以比较脏的环境样本对核酸提取试剂的要求也比较高。环境样本可以直接进行提取操作，如含杂质过多可短暂静置或离心，取上清进行核酸提取操作。
06 组织样本
研究表明，猪感染非瘟病毒后，体内器官感染顺序依次是脾脏、扁桃体、淋巴结等，随着时间推移，不同组织中检出的效果便不再有差异。
组织样本作为核酸提取样本，一般需要用剪刀剪下1-2个黄豆粒大小组织，用2ml左右生理盐水进行组织研磨，研磨结束后取离心后上清进行病毒核酸提取及检测。
07 其他样本
粪便、精液、去势液等其他样本。由于粪便样本在经过肠胃的消化后病毒含量较低，精液等样本采集困难，所以此类样本也较少应用。
对于此类样本的核酸提取难度也较大，粪便中腐殖酸等抑制物含量很高，提取后核酸易抑制下游扩增；普通裂解液对裂解精液细胞释放核酸较困难，一般会用DTT作为样本前处理步骤。
2. 试剂
磁珠法提取核酸的方法是以超顺磁性的纳米磁性粒子为基质，这种磁性粒子在高浓度离液剂的条件下可通过氢键和静电特异的吸附核酸，而蛋白质或其它非特异吸附的少量杂质经洗涤被去除，最后用低盐缓冲液或RNase Free ddH2O洗脱核酸。纯化的核酸可适用于各种常规操作，包括荧光定量PCR、NGS相关的各种下游分子实验。
此方法具有以下优点：
- 安全无毒，不使用传统方法中的酚/氯仿等有毒试剂；
- 操作简单，提供预分装试剂，无需长时间接触实验试剂，整合流程自动化；
- 高通量提取，同时批量处理8/16/32/48/64/96个样本；
- 满足微量生物样本核酸提取的要求。
表1 不同样本背景稀释的非瘟质控品使用不同磁珠提取效果比较
3. 操作
01 裂解步骤
磁珠法核酸提取过程中的裂解和结合步骤可以分开也可以合并，主要区别是磁珠在哪个步骤开始参与核酸提取。一般会选择裂解结合两步骤共同进行，可以将磁珠与核酸结合步骤做到作用最大化。
裂解步骤中裂解液一般会含有较高浓度的离液盐和表面活性剂，不仅为磁珠与核酸结合提供高盐环境，而且可以将核酸从细胞中裂解释放出来。
而裂解步骤需不需要加蛋白酶K，一般跟样本类型有关，血液类样本由于含有较多蛋白及细胞成分，辅助加入蛋白酶K会促进核酸从核酸蛋白复合体中释放。而背景干净的环境样本，由于裂解液对于核酸的释放作用已足够，所以是否加入蛋白酶K对结果几乎无影响。
其次裂解时间及裂解温度对于裂解充不充分也影响较大。相同裂解温度下的裂解时间长短会影响裂解效果，时间过短裂解不充分影响核酸释放，时间过长可能会造成核酸片段化；相同裂解时间下的裂解温度高低也会影响裂解效果，温度过低可能造成裂解不充分影响核酸释放，温度过高可能也会造成核酸降解风险，但实际上裂解温度有可能是50-90°C。根据不同厂家的核酸提取仪性能和预分装耗材的差异，程序设置温度可能会与预分装中实际运行温度相差10-20°C，裂解温度及时长需要根据裂解液的裂解能力做出选择。
02 漂洗步骤
漂洗步骤对于复杂的猪场样本种类来说也是重要步骤，漂洗液的漂洗能力对于背景干净的样本和背景复杂的样本需要做到兼容，既不能造成简单样本的核酸损失，也需要做到对复杂样本除杂的效果。同样地，漂洗次数和漂洗时间长短也需要做到对简单样本和复杂样本地兼容。
03 洗脱步骤
核酸提取试剂洗脱液一般为低盐缓冲液或 RNase Free ddH2O。洗脱步骤影响核酸提取的因素是洗脱时间和温度，与裂解步骤类似，洗脱时间过长或者过短，洗脱温度过高或者过低，都可能会对核酸从磁珠中的洗脱效率和核酸降解产生影响。洗脱时间和温度的选择需要根据提取病毒的特点及下游扩增结果进行选择。
此外，除了核酸提取，真实结果的产出还需要提取后灵敏高效的荧光定量检测试剂。正如上文提到的，猪场的环境纱布样本和唾液样本含量其中含有较多的泥土、饲料、唾液粘蛋白、粪便等成分，如果说提取试剂对此类样本提取的核酸纯度不够，含有较多腐殖酸等抑制物，或者搭配了抗逆效果不太好的下游扩增试剂盒，此时很容易抑制扩增。所以下游扩增选用抗逆性好和扩增灵敏度高的扩增试剂盒对于结果的准确度也是至关重要的。
济凡生物致力于成为国内领先的生物样本保存、提取、检测整体解决方案的科技创新型公司。经过长期探索与创新，济凡现已拥有一套成熟的核酸纯化体系，以其优异的操作便利性，样本兼容性和高检出率，深受客户认可，截止目前，已提供超过1500万头份病毒提取试剂。大量数据表明济凡磁珠法动物病毒DNA/RNA提取试剂盒具有优异的提取性能。
产品优势：
1.样本兼容性好:通用提取各种DNA和RNA病毒样本、包括唾液、拭子、纱布、全血、血清、组织匀浆液等各种样本或各种病毒保存液中的样本；
2.操作简单快速：配合自动化提取仪，仅需加入样本，15min即可完成提取；
3.高检出率：病毒提取效率高，尤其对低拷贝病毒样本具有较优的检出性能。
▼样本兼容性好
▼竞品对比数据
参考文献：
[1] Berensmeier, Sonja. 2006. “Magnetic Particles for the Separation and Purification of Nucleic Acids.” Applied Microbiology and Biotechnology. https://doi.org/10.1007/s00253-006-0675-0.[2] Galindo, Inmaculada, and Covadonga Alonso. 2017. “African Swine Fever Virus: A Review.” Viruses. MDPI AG. https://doi.org/10.3390/v9050103.
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