细胞冻存和复苏实验
2022-09-05 来源:本站 点击次数:1353
实验方法原理：
一、细胞冻存
1.10%DMSO或甘油冷冻培养基的制备10～20%小牛血清。
2. 对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，悬液中生长的细胞直接移到15 ml离心管。
3. 离心机转速1000转，5分钟。
4. 除去胰蛋白酶和旧培养基，加入适量配制好的冷冻培养基。用吸管轻轻吹气使细胞均匀、计数，调整冻液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。
5. 细胞分成深低温保存管，每管1～1.5ml。。
6. 低温保存管上标明细胞名称、冷冻时间和操作人员。。
7. 冷冻：标准的冷冻程序是冷却速度为—1～—2°C/min。温度低于—25℃时，可提高到—5°C~-10°C / min.。在—100℃时，可快速浸入液氮中。。含有细胞的冷冻保存管也可以放在—20°C的冰箱里2个小时，然后放入—70°D的冰箱中过夜。取出冷冻管并将其移到液氮容器中。。
三、 细胞复苏
1. 将冷冻管从液氮容器中取出，直接浸入37°C温水中，并不时摇晃，使其尽快融化。。
2. 从37°C水浴中取出冻存管，打开盖子，用移液器吸出细胞悬液，加入离心管滴下培养液10倍以上，搅拌均匀。。
3. 离心，1000转/分钟，5分钟。
4. 弃去上清液，加入10%小牛血清培养基悬浮细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37°C培养箱培养。
5. 第二天更换培养基，继续培养。。
注册事项：
1. 从增殖期到形成致密单层细胞的培养细胞可用于低温保存，但优选对数生长期细胞。冷冻前一天最好换培养基。
2. 将冷冻储存管放入液氮容器或取出时，要做好防护工作，避免冻伤。。
3. 冷冻复苏时，最好使用新配制的培养基。
细胞冻存和复苏的基本原理是慢冻快解冻，已被证明能最大限度地提高细胞活力。目前常用甘油或二甲基亚砜作为细胞低温保存的保护剂。这两种物质可以提高细胞膜对水的渗透性，再加上缓慢的冷冻可以使细胞内的水从细胞中渗出，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶形成对细胞的损伤。复苏细胞时应采用快速熔融的方法，以保证细胞外晶体在短时间内熔融，以避免因水缓慢熔融进入细胞形成细胞内重结晶而对细胞造成损伤。
实验步骤：一、细胞冻存
1.10%DMSO或甘油冷冻培养基的制备10～20%小牛血清。
2. 对数生长期细胞用胰蛋白酶消化，悬液中生长的细胞直接移到15 ml离心管。
3. 离心机转速1000转，5分钟。
4. 除去胰蛋白酶和旧培养基，加入适量配制好的冷冻培养基。用吸管轻轻吹气使细胞均匀、计数，调整冻液中细胞的最终密度为5×106/ml～1×107/ml。
5. 细胞分成深低温保存管，每管1～1.5ml。。
6. 低温保存管上标明细胞名称、冷冻时间和操作人员。。
7. 冷冻：标准的冷冻程序是冷却速度为—1～—2°C/min。温度低于—25℃时，可提高到—5°C~-10°C / min.。在—100℃时，可快速浸入液氮中。。含有细胞的冷冻保存管也可以放在—20°C的冰箱里2个小时，然后放入—70°D的冰箱中过夜。取出冷冻管并将其移到液氮容器中。。
三、 细胞复苏
1. 将冷冻管从液氮容器中取出，直接浸入37°C温水中，并不时摇晃，使其尽快融化。。
2. 从37°C水浴中取出冻存管，打开盖子，用移液器吸出细胞悬液，加入离心管滴下培养液10倍以上，搅拌均匀。。
3. 离心，1000转/分钟，5分钟。
4. 弃去上清液，加入10%小牛血清培养基悬浮细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37°C培养箱培养。
5. 第二天更换培养基，继续培养。。
注册事项：
1. 从增殖期到形成致密单层细胞的培养细胞可用于低温保存，但优选对数生长期细胞。冷冻前一天最好换培养基。
2. 将冷冻储存管放入液氮容器或取出时，要做好防护工作，避免冻伤。。
3. 冷冻复苏时，最好使用新配制的培养基。
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