多肽合成仪的发明和应用简介
2023-03-21 来源:自然基因 点击次数:1469 美国洛克菲勒大学教授Bruce Merrifield 在1963年发明的多肽固相合成技术（SPPS）是多肽合成领域的一个重大突破，对化学，生化，医药，免疫和基因科学等学科和领域都起了巨大的推动作用。 他本人也因此项发明荣获1984化学诺贝尔奖。
固相合成法的诞生
多肽合成研究已经走过了一百多年的光辉历程。1902年，Emil Fischer首先开始关注多肽合成，由于当时在多肽合成方面的知识太少，进展也相当缓慢，直到1932年，Max Bergmann等人开始使用苄氧羰基(Z)来保护α-氨基，多肽合成才开始有了一定的发展。到了20世纪50年代，有机化学家们合成了大量的生物活性多肽，包括催产素，胰岛素等，同时在多肽合成方法以及氨基酸保护基上面也取得了不少成绩，这为后来的固相合成方法的出现提供了实验和理论基础。
1963年，Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS)，这个在多肽化学上具有里程碑意义的合成方法，一出现就由于其合成方便，迅速，成为多肽合成的首选方法，而且带来了多肽有机合成上的一次革命，并成为了一支独立的学科——固相有机合成(SPOS)，为此，Merrifield荣获了1984年的诺贝尔化学奖。Merrifield经过了反复的筛选，最终屏弃了苄氧羰基(Z)在固相上的使用，首先将叔丁氧羰基(BOC)用于保护α-氨基并在固相多肽合成上使用，同时，Merrifield在60年代末发明了第一台全自动多肽合成仪，并首次合成生物蛋白酶，核糖核酸酶(124个氨基酸)。
1972年，Lou Carpino首先将9-芴甲氧羰基(FMOC)用于保护α-氨基，其在碱性条件下可以迅速脱除，10min就可以反应完全，而且由于其反应条件温和，迅速得到广泛使用，以BOC和FMOC这两种方法为基础的各种肽自动合成仪也相继出现和发展，并仍在不断得到改造和完善。同时，固相合成树脂，多肽缩合试剂以及氨基酸保护基，包括合成环肽的氨基酸正交保护上也取得了丰硕的成果。
多肽合成仪的诞生
多肽固相合成技术的发明同时促进了肽合成的自动化。世界上第一台真正意义上的多肽合成仪出现在1960年代末至1970年代初期，它是利用氮气鼓泡或者震荡来对反应物进行搅拌，用计算机程序控制来实现有限度的自动合成。即为后来总结归纳出的第一代多肽合成仪。虽然在搅拌方式和其他各项功能方面有着明显的缺陷，但是它毕竟把人从实验室里解放出来，极大地提高了工作效率，所以受到了多肽科学家的一致赞扬。
多肽合成仪的运行原理
多肽合成仪以固相合成为反应原理，在密闭的防爆玻璃反应器中使氨基酸按照已知顺序（序列，一般从C端-羧基端 向 N端-氨基端）不断添加、反应、合成，操作最终得到多肽载体。固相合成法，大大的减轻了每步产品提纯的难度。为了防止副反应的发生，参加反应的氨基酸的侧链都是保护的。羧基端是游离的，并且在反应之前必须活化。固相合成方法有两种，即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多优势，现在大多采用Fmoc法合成，但对于某些短肽，tBoc因其产率高的优势仍然被很多企业所采用。
多肽合成仪具体合成由下列几个循环组成：
1） 去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine）去 除氨基的保护基团。
2） 激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。活化的单体与游离的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。循环：这两步反应反复循环直到合成完成。
3） 洗脱和脱保护：多肽从柱上洗脱下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA） 洗脱和脱保护。
多肽合成仪的检测方法
a) UV Monitor
多肽合成仪的检测方法
a) UV Monitor
在多肽合成仪中，在线检测耦合效果的装置，如UV Monitor往往是选配装置，客户可根据实验的需要选购。其功能是让操作者直观的看到多肽合成的每一部氨基酸偶联效果，从而针对特定的序列做合成设置的调整，最终达到最佳合成效果。
对于不熟悉多肽合成仪操作的用户来说，UV Monitor是相当重要的。
b) 试剂检测
没有选购在线检测附件的多肽合成仪用户，也可以采用试剂检测方法做基本的耦合效果测定实验。
固相多肽合成中，主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率，检测方法称为Kaiser方法，其检测结果，如果有游离氨基的时候，显示兰色，或红褐色（pro，ser，His）。
Kaiser试剂包括：A，6% 茚三酮的乙醇溶液；B，80% 苯酚的乙醇溶液；C，2% 0.001M KCN的吡啶溶配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后，重蒸后再使用。检测过程，取少量树脂，加入A，B，C各2-3滴，100℃下加热1-2min，如果溶液有兰色，或树脂出现兰色，红褐色，表明还有游离氨基，否则说明连接完全。
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