鼠尾胶原蛋白在细胞培养器皿的表面包被上的应用及三维胶原制备方法
2023-04-13 来源:absin 点击次数:2730胶原蛋白是结缔组织和内脏器官细胞外基质的主要构造成分，在皮肤、肌腱、骨骼中分布最为广泛。从遗传和结构上胶原蛋白分为许多类型。
胶原蛋白I（Collagen, Type I）是由2个α1 链和1个α2 链组成的异源多聚体（图1），在37℃，中性pH 下自发形成三螺旋骨架，是一种优秀的细胞培养用基质，广泛用于肝细胞、成纤维细胞、脊神经节、肌肉细胞、施万细胞、胚肺细胞、上皮细胞和其他大量细胞系。还能用于研究细胞生长、分化、迁移以及发育过程中的组织形态发生。
图1 胶原蛋白I分子模型
鼠尾胶原蛋白I 是根据Birkedal-Hansen 方法，通过醋酸抽提、氯化钠沉淀、磷酸氢二钠沉淀等步骤制备。可用于包被细胞培养器皿，培养细胞表面粘附性，特别适合那些在普通培养器皿表面不易贴壁的细胞，比如成纤维细胞、肝细胞等原代细胞。还可用于三维胶的制备，模拟真实的生长环境，使得细胞在三维环境中生长。
组织培养器皿的表面包被推荐浓度为1-5μg/cm2，起始浓度可首选5μg/cm2。建议根据具体细胞类型来优化。
本品以溶于6mM HAc（=0.36g/L HAc）的无菌溶液形式提供，本身不溶于中性pH，建议用6mM HAc溶液做进一步稀释。配制方法：取34.5μl 冰醋酸（17.4M）加入100ml双蒸水，充分混匀后即得到6mM HAc溶液，0.22μm滤膜过滤除菌后待用。
1）根据自身实验体系以及优化后的包被浓度来计算所需的胶原蛋白量，并加入相应孔内，确保胶原蛋白溶液完全覆盖表面。
a. 以包被浓度为 5μg/cm2，先用6mM HAc稀释液将胶原蛋白（5mg/ml）稀释到合适的中间浓度，如50μg/ml， 然后参考表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内；
b. 以包被浓度为 2μg/cm2，先用6mM HAc稀释液将胶原蛋白（5mg/ml）稀释到合适的中间浓度，如12μg/ml，然后参考表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表来加量到各孔内；
表1 不同培养皿内胶原蛋白加量表
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培养器皿 |
表面积（cm2,每孔或每皿） |
当包被浓度：2ug/cm2，中间稀释浓度12ug/ml，加入该稀释液体积（ul） |
当包被浓度：5ug/cm2，中间稀释浓度50ug/ml，加入该稀释液体积（ul） |
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96孔细胞培养板 |
0.3 |
50 |
30 |
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24孔细胞培养板 |
1.9 |
300 |
190 |
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12孔细胞培养板 |
3.8 |
600 |
380 |
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6孔细胞培养板 |
9.5 |
1580 |
950 |
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35mm细胞培养皿 |
8 |
1330 |
800 |
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60mm细胞培养皿 |
21 |
3500 |
2100 |
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100mm细胞培养皿 |
55 |
9170 |
5500 |
2）室温孵育1h，小心吸掉多余液体，用无菌PBS清洗3~4次后直接使用。或者加完胶原蛋白溶液后，在超净台内开盖过夜晾干。无菌条件下，包被好的器皿在4-25°C至少可保存3个月。
当鼠尾胶原蛋白I使用浓度>1mg/ml，pH 7.0左右皆可形成具有一定强度的三维胶，建议成胶浓度为1-2 mg/ml。
由于本品是以溶于6mM HAc的无菌溶液形式提供，在成胶过程需先加入0.06倍体积的0.1M NaOH中和。
10×细胞培养液（依据培养的细胞种类而定）、0.1M NaOH、无菌水
1）取200μl胶原蛋白（5mg/ml）加到置于冰浴的离心管内，加入690μl无菌水。之后加到12μl 0.1M NaOH【注：该步骤不能反，如果反过来把12μl 0.1M NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】，立即混匀。再加入100μl 10×细胞培养液，混匀后立即加到培养器皿中。【注：混匀后pH为7.0左右，如果培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试】。
2）将培养器皿在室温（25°C左右）放置20min待胶凝固后，转移到培养箱内。
三维胶原制备（含细胞）（以配制1ml，1mg/ml三维胶为例）：
a. 准备好细胞悬液，并放置于冰浴中。b，将200μl胶原蛋白（5mg/ml）加到12μl 0.1M NaOH【注：该步骤不能反，如果反过来把12μl 0.1M NaOH加到胶原溶液中，会由于NaOH不能迅速混匀而产生局部的胶原凝结】，立即混匀。再加入23μl 10×细胞培养液，立即混匀【注：混匀后pH为7.0左右，如果培养液中没有加酚红，初次使用时需要用pH试纸测试】。再加入760μl 的细胞悬浮液，混匀后立即加到培养器皿中。
b. 将培养器皿在室温（25°C左右）放置20min待胶凝固后，加入适当体积细胞培养液，转移到培养箱中培养。
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