分选原理
选用生物素（biotin）标记的单克隆抗体对非目标细胞（非 CD3+ T 细胞）进行标记，然后通过链霉亲和素（streptavidin）标记的磁珠对非目标细胞进行清除，从而达到人外周血 CD3+ T 细胞分选的目的。分选过程需要用到磁力架。

分选试剂及仪器
人CD3+T细胞分选试剂盒（阴选法）(abs50126)

产品组成：

细胞磁性分离器（多功能）(abs90335）

分选方法
1、制备人 PBMC：利用 Ficoll 密度梯度离心法从人外周血中分离 PBMC，收集 PBMC，以 PBS
洗涤细胞，离心后将 PBMC重悬于分选 buffer中，调整细胞密度为 1×10⁸ cells/mL。

2、将 100 μL 细胞悬液（1×10⁷个细胞）加入无菌流式管底部，再加入 2 μL Biotin-Antibody Mix，混匀后4°C 孵育 10 min。
注意：将细胞悬液直接加入流式管底部，避免沿流式管管壁加入。根据所使用磁力架不同也可使用离心管进行细胞分选。如果分选更多细胞，则按比例增加 Biotin-Antibody Mix 的用量。

3、孵育完成后，在流式管中加入 20 μL 清洗过的 Streptavidin，混匀后 4°C 孵育 10 min（磁珠使用前需要用分选 buffer 进行清洗：涡旋振荡彻底重悬磁珠，取实验需要的磁珠至 1.5 mL 离心管，加入分选 buffer 至总体积为 1 mL，10000 g，离心 1 min，弃上清。加入 1 mL 分选 buffer 重悬磁珠，10000 g，离心 1 min，弃上清。用与起初相同体积的分选 buffer 重悬磁珠。如取 20 μL 磁珠进行清洗，则清洗后用 20 μL 分选 buffer 进行重悬）。
注意：如果分选更多细胞，则按比例增加 Streptavidin 用量。例如分选 5×10⁷ 个细胞，在 500 μL 细胞悬液中加入 10 μL Biotin-Antibody Mix 和 100 μL treptavidin。如果分选少于 1×10⁷个细胞，则将细胞悬液体积补至 100 μL，加入 2 μL Biotin-Antibody Mix 和 20 μL Streptavidin。

4、孵育完成后，在流式管中加入 2.5 mL 分选 buffer，用移液器吹打 5 次混匀（避免剧烈振荡或者上下颠倒混匀）。

5、将含有细胞的流式管置于磁力架上，静置 5 min。

6、将细胞悬液轻柔倒入一个无菌离心管中（倾倒过程中流式管不要脱离磁力架），此细胞悬液中即包含纯化的人 CD3+ T 细胞。300 g，离心 5 min。弃上清，收集细胞。

7、根据实验需要洗涤细胞后，将细胞重悬于所需缓冲液或培养基中，进行培养。

从人PBMC中分选CD3+ T细胞，用PE标记的 anti-human CD3抗体（克隆号OKT3）染色后进行流式细胞分析. 结论：分选前后的CD3+ T细胞纯度分别为69.1%和97.9%。

培养原理
人 CD3/CD28 T 细胞激活磁珠可以简单快捷的活化及扩增T 细胞，无需饲养层细胞（抗原递呈细胞）或抗原。磁珠为直径 5 µm 的惰性超顺磁珠，大小与抗原呈递细胞相似，同时共价偶联抗CD3 和抗CD28 抗体。细胞培养过程中可使用重组人 IL-2 刺激 T 细胞群扩增。活化或扩增后，磁珠可以通过磁力架轻松去除。

培养步骤
一、试剂配置
1、清洗 buffer：含有 2 mM EDTA 和 2% 胎牛血清（FBS）的 PBS 或者含有 2 mM EDTA 和 5% BSA的 PBS，需预先通过 0.22 μm 滤膜过滤除菌。
2、免疫细胞无血清培养基(abs9772)；
3、IL-2(abs04045)；
4、CD3/CD28磁珠(abs160032)；
5、青霉素-链霉素溶液(100×,双抗)（abs9244）

二、操作步骤
1、清洗磁珠
（1）彻底重悬试管中的磁珠（如涡旋>30秒，或置于旋转仪5分钟）。
（2） 吸取目标体积的磁珠至流式管中，加入同等体积的清洗Buffer。若不足1mL，添加1mL的清洗Buffer，涡旋5秒，或使用移液器吹打混匀，注意避免产生气泡（此处也可直接使用细胞培养基清洗）。
（3）将流式管置于磁力架上3分钟，弃上清。
（4）重复步骤2-3，本次使用细胞培养基对磁珠再次清洗。共清洗磁珠两次。
（5） 使用细胞培养基重悬磁珠（比如：吸取 25 μL 磁珠进行清洗，清洗后用 1 mL 细胞培养基进行重悬）。

注意事项
取用激活磁珠前彻底重悬磁珠（如涡旋>30秒，或置于旋转仪5分钟），吹打时避免产生气泡。进行流式检测前，使用磁力架去除磁珠（包括结合在细胞上的磁珠，可以通过轻柔吹打释放磁珠），此时细胞位于上清液中。收集上清液，进行下一步的流式检测。

2、人 T 细胞的扩增
（1）调整CD3+ T细胞种板浓度为1-1.5 x 10⁶ cells/mL，按照磁珠与细胞比例1：1加入激活磁珠。
（2）激活 2天后，向培养基中添加 300 U/mL 的重组人 IL-2。
（3）细胞与磁珠放于 37℃，5% CO₂培养箱中孵育，根据实验需要决定细胞的培养时长。
  (4)  每日查看细胞激活与扩增情况，注意细胞的大小和形状。当细胞皱缩或增殖速度明显放慢时，提示细胞可能耗竭。
（5）推荐在细胞激活的前 2天时不要处理细胞，2 天后随时观察细胞状态，当培养基变黄或孔内细胞数目过多时换液或传代。每次换液或传代后，应及时补充重组人 IL-2 至 300 U/mL。
（6）定期进行细胞计数，当细胞密度超过 5x 10⁶ cells/mL 时，轻柔吹打混匀，将细胞密度调整为 0.5-1 x 10⁶ cells/mL。

刚接种的 T 细胞（棕色为抗体欧联磁珠）	T 细胞-day5-细胞增殖明显（T细胞团）

活化人T细胞的PD-1表达。人T细胞用抗人CD3/CD28磁珠刺激，并扩增14天


使用人CD3/CD28 T细胞激活磁珠，刺激CD3+ T细胞24到48小时，细胞用FITC anti-human CD69抗体（克隆号FN50 ）和PE anti-human CD25抗体（克隆号BC96）标记，进行流式细胞仪分析。 结论：刺激前后CD25+ CD69+ T细胞占总细胞的比例分别为0.70% 和75.81%

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