人/小鼠组织样本制备、磁珠分选、结果验证标准化操作流程
2026-03-27 来源:本站 点击次数:73一、样本制备-Human外周血样本
Human外周血样本-磁珠分选验证流程
密度梯度离心法操作步骤：
1,样本预处理：将白细胞层用PBS按3:2（样本:PBS）比例稀释，1100 g（2500 rpm）离心10分钟（无制动）。
2,收集白细胞：收集离心后形成的中间层（主要含白细胞），用PBS重悬并定容至20 mL。
3,密度梯度分离：将上述细胞悬液小心加至12 mL Ficoll溶液（密度1.077 g/ml）上层。1100 g（2500 rpm）离心20分钟（无制动）。
4,收集PBMCs：离心后，收集位于Ficoll层与血浆层之间的云雾状PBMCs层。
5,洗涤：用PBS将PBMCs重悬并定容至10 mL，按以下顺序洗涤三次：
6,第一次：250 g（1200 rpm）离心10分钟。
7,第二、三次：110 g（800 rpm）离心5分钟（后两次可在4°C进行以利于去除血小板）。
8,计数：末次离心前，取少量样本，用细胞计数板于光学显微镜下进行细胞计数。
二、样本制备-Mouse脾脏样本
小鼠脾脏样本制备：
1.将脾脏组织转移到70μm细胞过滤器，置于15或50mL无菌锥形管上，并用1ml推荐培养基润洗滤网。注意：细胞可能会黏附于干燥的滤网上，润洗滤网可以减少这种情况。
2.从5ml无菌注射器中取出活塞/柱塞。使用扁平的末端部分以温和画圆的方式研磨脾脏，碾磨至无明显红色结团为止，这样可以破坏脾脏和髓质，释放脾细胞。
3.使用润洗过的1mL移液枪将脾细胞吹打均匀。
4.将收集到离心管里的脾脏细胞平衡后放置于离心机离心，转速为300g，离心时间5min。取出离心管，倒去上清，轻轻敲击试管重悬细胞。
三、案例展示：采用磁珠分选技术分离CD3+T细胞
T淋巴细胞（CD3+ 细胞） 采用 CD3 微珠（阳性选择法） ，具体步骤如下：
在确定外周血单个核细胞（PBMCs） 的大致总数后，弃去最后一次离心产生的上清液，将沉淀物按每10 7个细胞80 μl 的比例重悬于磁珠缓冲液（附录II） 中 。 随后通过加入20 μl 溶液对细胞进行标记。
CD3微珠按供应商规格配置，每10 7个细胞使用一个微珠 。将细胞悬液充分混匀后置于4 ºC 培养箱中孵育 。 15分钟后，加入微珠缓冲液将细胞稀释至终体积10毫升， 以250g（1200转/分钟） 离心10分钟进行洗涤 。 随后将沉淀物再次稀释，此时细胞浓度为10 ^8个/500 μl ，即可进行磁珠分离。
与此同时， 将LS层析柱置于分离器的磁场环境中， 并用3毫升磁珠缓冲液进行冲洗 。待柱体储液槽排空后，将细胞悬液上样至柱体并收集流出液 。 随后使用3毫升磁珠缓冲液对柱体进行三次洗涤，每次洗涤前必须确保储液槽完全排空 。此时收集的总流出液仅包含未标记细胞（CD3-） ，即分离过程中的阴性组分。
为获取标记细胞（阳性组分） ，将层析柱转移至15 ml离心管中，并加入5 ml磁珠缓冲液进行上样。
随后，将配备色谱柱的柱塞立即投入使用，并收集洗脱组分 。该洗脱组分即为目标CD3+ 细胞组分 。分离后的细胞在细胞计数板中进行计数， 并通过流式细胞术进行质量控制评估 。 分离细胞经250g（1200转/分钟） 离心10分钟后 ，重悬于冷冻培养基中， 细胞浓度为6.25 × 10 ^6个/毫升， 随后于-80 ºC 条件下冷冻保存以备后续使用。
其他案例数据展示：
试剂及产品清单
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产品名称 |
货号 |
品牌 |
用途说明 |
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Ficoll溶液 (密度1.077g/ml) |
absin |
密度梯度离心介质，用于从外周血中分离外周血单个核细胞。 |
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CD3 Nanobeads, human (RUO) |
S0B1852 |
starter |
用于阳性分选人CD3+ T细胞的磁性标记微珠。 |
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CD4 Nanobeads, human (RUO) |
S0B5740 |
starter |
用于阳性分选人CD4+ T细胞的磁性标记微珠。 |
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CD8 Nanobeads, human (RUO) |
S0B5741 |
starter |
用于阳性分选人CD8+ T细胞的磁性标记微珠。 |
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CD14 Nanobeads, human (RUO) |
starter |
用于阳性分选人CD14+ 单核细胞的磁性标记微珠。 |
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CD45 Nanobeads, human (RUO) |
starter |
用于阳性分选人CD45+ 白细胞（泛白细胞）的磁性标记微珠。 |
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CD45 Nanobeads, mouse (RUO) |
starter |
用于阳性分选小鼠CD45+ 白细胞（泛白细胞）的磁性标记微珠。 |
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CD4 Nanobeads, mouse (RUO) |
starter |
用于阳性分选小鼠CD4+ T细胞的磁性标记微珠。 |
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CD8 Nanobeads, mouse (RUO) |
starter |
用于阳性分选小鼠CD8+ T细胞的磁性标记微珠。 |
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CD19 Nanobeads, human (RUO) |
starter |
用于阳性分选人CD19+ B细胞的磁性标记微珠。 |
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Starter MagSep Separation Buffer |
starter |
用于重悬、洗涤细胞以及冲洗分选柱的专用缓冲液，通常含BSA和EDTA。 |
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S Separation Columns |
starter |
用于阳性或阴性分选的分选柱，置于磁场中使用。 |
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L Separation Columns |
starter |
用于阳性或阴性分选的分选柱，置于磁场中使用。 |
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Starter MagSep Separator (4L) |
starter |
与分选柱配套使用的分选器，提供磁场 |
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MultiStand |
starter |
磁力架 |