单核来源树突状细胞的分离培养攻略
2026-03-27 来源:本站 点击次数:84
本流程以磁珠分选阳性选择法为核心，完成人源 CD14 + 单核细胞的分选，并开展后续树突状细胞（DC）的诱导分化，为后续人源树突状细胞功能验证及 T 细胞激活功能检测实验提供实验基础与操作依据。
一、人源树突状细胞诱导及T细胞激活功能检测实验
1,在确定外周血单个核细胞（PBMCs） 的大致总数后，弃去最后一次离心产生的上清液，将沉淀物按每10 7个细胞80 μl 的比例重悬于磁珠缓冲液（附录II） 中 。 随后通过加入20 μl 溶液对细胞进行标记。
2,CD14微珠按供应商规格配置，每10 7个细胞使用一个微珠 。将细胞悬液充分混匀后置于4 ºC 培养箱中孵育 。 15分钟后，加入微珠缓冲液将细胞稀释至终体积10毫升， 以250g（1200转/分钟） 离心10分钟进行洗涤 。 随后将沉淀物再次稀释，此时细胞浓度为10 ^8个/500 μl ，即可进行磁珠分离。
3,与此同时， 将LS层析柱置于分离器的磁场环境中， 并用3毫升磁珠缓冲液进行冲洗 。待柱体储液槽排空后，将细胞悬液上样至柱体并收集流出液 。 随后使用3毫升磁珠缓冲液对柱体进行三次洗涤，每次洗涤前必须确保储液槽完全排空 。此时收集的总流出液仅包含未标记细胞（CD14-） ，即分离过程中的阴性组分。
4,为获取标记细胞（阳性组分） ，将层析柱转移至15 ml离心管中，并加入5 ml磁珠缓冲液进行上样。
5.随后，将配备色谱柱的柱塞立即投入使用，并收集洗脱组分 。该洗脱组分即为目标CD14+ 细胞组分 。分离后的细胞在细胞计数板中进行计数， 并通过流式细胞术进行质量控制评估 。 分离细胞经250g（1200转/分钟） 离心10分钟后 ，重悬于冷冻培养基中， 细胞浓度为6.25 × 10 ^6个/毫升， 随后于-80 ºC 条件下冷冻保存以备后续使用。CD4+ T细胞分选同理。
单核细胞（CD14+ 细胞）分离完成后，将其重悬于培养基 中 ，浓度为1× 10 6个细胞/毫升， 并添加750 U/mL白细胞介素（IL）-4和1000 U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF） 以促进其向树突状细胞（DC）分化 。 随后将细胞悬液分装至24孔培养板（每孔1 ml）中。
细胞被转移至培养箱 中 ， 并在37 ºC 、 含5%CO2 的湿润环境中进行培养 。 每隔两天， 轻柔地移除一半培养基， 并替换为等量新鲜培养基 ， 同时补充与先前所述相同浓度的IL-4和GM-CSF 。经过7天的细胞因子培养后 ，单核细胞已分化为树突状细胞（DCs） ， 为评估其成熟度及细胞死亡率，这些细胞被移出培养体系。
此时可能需要确定分化效率， 该指标将初始待分化的树突状细胞（DCs）数量与单核细胞数量相关联。
试剂及耗材清单
一、人源树突状细胞诱导及T细胞激活功能检测实验
1,在确定外周血单个核细胞（PBMCs） 的大致总数后，弃去最后一次离心产生的上清液，将沉淀物按每10 7个细胞80 μl 的比例重悬于磁珠缓冲液（附录II） 中 。 随后通过加入20 μl 溶液对细胞进行标记。
2,CD14微珠按供应商规格配置，每10 7个细胞使用一个微珠 。将细胞悬液充分混匀后置于4 ºC 培养箱中孵育 。 15分钟后，加入微珠缓冲液将细胞稀释至终体积10毫升， 以250g（1200转/分钟） 离心10分钟进行洗涤 。 随后将沉淀物再次稀释，此时细胞浓度为10 ^8个/500 μl ，即可进行磁珠分离。
3,与此同时， 将LS层析柱置于分离器的磁场环境中， 并用3毫升磁珠缓冲液进行冲洗 。待柱体储液槽排空后，将细胞悬液上样至柱体并收集流出液 。 随后使用3毫升磁珠缓冲液对柱体进行三次洗涤，每次洗涤前必须确保储液槽完全排空 。此时收集的总流出液仅包含未标记细胞（CD14-） ，即分离过程中的阴性组分。
4,为获取标记细胞（阳性组分） ，将层析柱转移至15 ml离心管中，并加入5 ml磁珠缓冲液进行上样。
5.随后，将配备色谱柱的柱塞立即投入使用，并收集洗脱组分 。该洗脱组分即为目标CD14+ 细胞组分 。分离后的细胞在细胞计数板中进行计数， 并通过流式细胞术进行质量控制评估 。 分离细胞经250g（1200转/分钟） 离心10分钟后 ，重悬于冷冻培养基中， 细胞浓度为6.25 × 10 ^6个/毫升， 随后于-80 ºC 条件下冷冻保存以备后续使用。CD4+ T细胞分选同理。
单核细胞（CD14+ 细胞）分离完成后，将其重悬于培养基 中 ，浓度为1× 10 6个细胞/毫升， 并添加750 U/mL白细胞介素（IL）-4和1000 U/mL粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF） 以促进其向树突状细胞（DC）分化 。 随后将细胞悬液分装至24孔培养板（每孔1 ml）中。
细胞被转移至培养箱 中 ， 并在37 ºC 、 含5%CO2 的湿润环境中进行培养 。 每隔两天， 轻柔地移除一半培养基， 并替换为等量新鲜培养基 ， 同时补充与先前所述相同浓度的IL-4和GM-CSF 。经过7天的细胞因子培养后 ，单核细胞已分化为树突状细胞（DCs） ， 为评估其成熟度及细胞死亡率，这些细胞被移出培养体系。
此时可能需要确定分化效率， 该指标将初始待分化的树突状细胞（DCs）数量与单核细胞数量相关联。
试剂及耗材清单
|
用途 |
产品编号 |
产品名称 |
品牌 |
|
PBMC获得 |
人淋巴细胞分离液 |
Absin |
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单核细胞获得 |
CD14 Nanobeads, human (RUO) |
Starter |
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T细胞获得 |
S0B5740 |
CD4 Nanobeads, human (RUO) |
Starter |
|
T细胞激活 |
NA/LE Mouse anti-human CD3 mAb |
Starter |
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|
T细胞激活 |
NA/LE Mouse anti-human CD28 mAb |
Starter |
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|
IL-4细胞因子 |
IL-4 Protein, Human |
UA |
|
|
GM-CSF细胞因子 |
GM-CSF Protein, Human |
UA |
|
|
IL-6细胞因子 |
IL-6 Protein, Human |
UA |
|
|
TNF细胞因子 |
TNF-α Protein, Human |
UA |
|
|
细胞增殖检测 |
CFSE |
Absin |
|
|
流式检测 |
- |
CD14, CD11C, CD80, CD86, HLA-DR, CD209, CD3, CD4, CD8, CD69, KI-67 (流式检测抗体) |
Starter |
|
细胞因子检测 |
- |
IL-2, TNF, IFN (ELISA试剂盒) |
LabEx |
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