导读

 

慢性炎症和T细胞失调在感染人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的个体中持续存在，即使在成功的抗逆转录病毒治疗后也是如此。所涉及的机制尚未完全理解。在这里，我们使用Olink蛋白质组学全面分析了慢性HIV-1感染个体中的异常炎症相关蛋白（IRP），包括24个未接受治疗个体、33个免疫应答者和38个免疫无应答者。使用流式细胞术评估T细胞功能障碍为T细胞耗竭、活化和分化。我们鉴定了一组IRP，包括CXCL11、CXCL9、TNF、CXCL10和IL18，它们与慢性HIV-1感染期间T细胞失调密切相关。有趣的是，聚类5中的IRP，包括ST1A1、CASP8、SIRT2、AXIN1、STAMBP、CD40和IL7，与HIV-1能力大小呈负相关。我们还鉴定了CDCP1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5，这可能有助于区分免疫应答者和免疫无应答者。总之，不同的炎症环境与T细胞的免疫恢复密切相关，我们的结果为慢性HIV-1感染期间的免疫失调提供了参考。

 

 

论文ID

 

原名：Distinct inflammation-related proteins associated with T cell immune recovery during chronic HIV-1 infection

译名：慢性HIV-1感染期间与T细胞免疫恢复相关的炎症相关蛋白

期刊：Emerging Microbes & Infections

IF：19.568

发表时间：2022.12

通讯作者：王福生、宋锦文

通讯作者单位：中国科学技术大学、国家感染性疾病临床医学研究中心

 

实验设计

 

实验结果

 

1. 研究参与者的特征

 

为了研究HIV-1感染者血浆IRP的特征和临床意义，本研究包括四组：20个健康个体（HCs）、24个未经过治疗的HIV-1的个体（TNs）、33个免疫应答者（IRs）和38个免疫反应无应答者（INR）（图1）。表1总结了参与者的特点，INR组年龄大于IR组，此外，INR组的基线CD4 T细胞计数低于IR组。

图1. 研究设计

 

外周血单核细胞（PBMC）和血浆采集自HCs、TNs、IRs和INRs。流式细胞术用于评估T细胞功能障碍，包括T细胞耗竭、活化和分化。使用O-link炎症面板测量92种IRP，还获得了参与者的临床参数，以分析IRP与HIV-1临床参数和T细胞失调之间的关系。

表1. 研究对象的临床特征

 

连续变量表示为中位数，分类变量表示为病例数。HC：健康对照；TN：未经过治疗的HIV-1的个体；IR：免疫应答者；INR：免疫无应答者；BMI：体重指数；ART：抗逆转录病毒疗法；NA：不可用；LDL：低于检测下限；NRTI：核苷逆转录酶抑制剂；NNRTI：非核苷逆转录酶抑制剂；PI：蛋白酶抑制剂。

 

2. HIV-1感染个体的T细胞分化

 

我们使用流式细胞仪分析评估了HIV-1感染个体的CD4和CD8 T细胞亚群组成。基于CD45RA、CD27和CCR7的表达来鉴定T细胞亚群。使用统一方法可视化了四组PBMC中T细胞亚群的分布和CD8、CD45RA、CD27和CCR7的表达（图2A）。在CD4 T细胞中，过渡记忆（T_TM）细胞的频率降低，但与HCs相比，TNs中效应记忆（T_EM）和末端分化（T_TD）细胞的频率增加（图2B）。在CD8 T细胞中，TN的中心记忆（T_CM）细胞的频率降低，而TNs中T_TM和T_EM细胞的频率比HCs中更多（图2C）。虽然ART长期抑制HIV-1复制，但T细胞亚群的分布并未完全恢复。在INRs中，CD4⁺ T_EM的频率、CD8⁺T_EM和CD4⁺T_TD细胞增加，CD4⁺T_N的频率和CD8⁺T_N细胞与IRs和HCs相比有所下降（图2B&C）。

图2. HIV-1感染个体的T细胞亚群

 

使用流式细胞术测定外周血单个核细胞（PBMC）中CD45RA、CD27和CCR7的表达。T细胞亚群的定义如下：未经处理的（T_N；CD45RA^-CD27⁺CR7⁺）、中心记忆（T_CM；CD45RA^-CD27⁺CCR7⁺）、过渡记忆（T_TM；CD45LA⁻CD27⁺CCR7^-）、效应记忆（T_EM；CD45RA⁻CD27^-CR7^-）和末端分化/效应器（T_TD/TE；CD45LA⁺CD27⁺CCR6^-）。（A） HCs、TNs、IRs和INRs中T细胞亚群的整合分析。高维映射上的每个点代表一个单独的细胞，以不同的颜色显示细胞亚群；（B-C）HCs中（B）CD4和（C）CD8 T细胞亚群的比例（n=20），TNs（n=23），IRs（n=33）和INRs（n=38)。数据用中位数表示，每个点代表一个参与者。使用非参数非配对Mann-Whitney U检验确定两组之间的统计显著性。

 

我们还评估了T细胞上活化和耗竭标记物的表达。我们发现，与HCs相比，TNs的T细胞活化和耗竭显著增加，ART不能完全恢复正常功能，尤其是INRs。INR组中HLA-DR⁺、CD38⁺和HLA-DR⁺ CD38⁺CD4 T细胞的频率高于IR组，而对于PD-1⁺CD4和PD-1⁺CD8的T细胞，INRs组高于IRs和HCs组。

 

3. 血浆中可溶性IRPs

 

我们使用Olink多重炎症小组测量了92个IRP，以研究HIV-1感染个体血浆IRP的临床意义。基于IRP表达的t-SNE分析清楚地将HCs、TNs和HIV-1感染的ART患者分开（图3A）。HIV-1感染个体（TNs、IRs和INR）和HCs之间有52个IRP显著差异（图3B）；TNs和HCs之间有41个IRP显著差异，IRs和HCs之间有26个IRP显著差异，INR和HCs间有34个IRP显著差异。此外，27个IRP在IRs和TNs之间存在显著差异，27个INR和TNs，9个IRs和INR。使用热图显示这些IRP的差异表达（图3C）。HIV-1感染的个体和HCs，特别是TNs之间的IRP谱显著不同。

图3. HIV-1感染个体血浆中炎症相关蛋白的改变

 

（A）基于使用Olink平台检测到的血浆中IRP，对具有不同类别的个体进行分布式随机相邻嵌入可视化；（B）Venn图显示了不同组合中差异表达IRP的数量[TNs与HCs、IRs与HCs、INRs与HCs]；（C）差异表达IRP的热图。

 

4. IRPs与TNs中HIV-1疾病进展相关

 

我们评估了TNs和HCs中41个差异表达IRP之间的成对相关性。根据相关系数将IRP分为七个聚类（图3A）。结合图3C所示的结果，HIV-1感染导致聚类1、4和5中IRP水平降低，聚类6和7中IRP水平升高。

我们进一步评估了IRP与TNs临床和免疫学变量之间的相关性；聚类7中的IRP与HIV-1疾病进展密切相关（图4B）。在聚类7中的IRP中，CD4 T细胞计数与CSF1、CXCL11、CCL23、IL12B、CCL19和CXCL10的水平呈负相关。HIV-1病毒载量与CSF1、CXCL11、IL12B、CCL19、IL10和CXCL9水平呈正相关。CD4⁺T_N和CD8⁺T_N细胞的频率与CSF1、CXCL11、CCL23、IL12B、CCL19、TNFRSF9、IL10、CXCL9、TNF、CXCL10和IL18的水平呈负相关。HLA-DR⁺CD38⁺CD4 T细胞的频率与CXCL11、CXCL9、CXCL10和IL18R1的水平呈正相关。HLA-DR⁺CD38⁺CD8 T细胞的频率与CXCL11、IL15RA、IL12B、CXCL9、TNF和CXCL10的水平呈正相关。PD-1⁺CD4 T细胞的频率与CSF1、CXCL11、CCL23、IL15RA、IL12B、CCL19、TNFRSF9、IL10、CXCL9、TNF、CXCL10、SLAMF1、IL18R1和IL18的水平呈正相关。PD-1⁺CD8 T细胞的频率与IFN-γ、IL15RA、TNFRSF9和IL18R1的水平呈正相关。

图4. 未经治疗的HIV-1感染个体中炎症相关蛋白与临床和免疫学变量的相关性

 

确定了TNs和HCs之间IRP的差异表达，（A）炎症相关蛋白（IRP）之间的相关性使用Spearman相关矩阵显示。基于IRP之间的相关性，这些蛋白质被分成七个聚类，聚类在热图黑框中突出显示；（B）热图显示差异表达蛋白与临床和免疫学变量之间的Spearman相关性，红色和蓝色分别表示正相关和负相关的关系。

 

我们还对聚类7中的17个IRP进行了GO分析，发现最具代表性的类别是炎症反应、NIK/NF-κB信号通路、趋化因子介导的信号通路、细胞对脂多糖的反应和干扰素-γ相关通路，这表明这些生物过程是在HIV-1感染期间发生改变。

 

5. IRP与ART患者的免疫恢复相关

 

我们发现，ART后，聚类7中CXCL11、CXCL9、TNF、CXCL10、SLAMF1、CST5、CDCP1和IL18的水平仍然异常。对ART患者的IRP与临床和免疫学变量之间的相关性分析表明，聚类7中的IRP异常与临床参数密切相关（图5）。在ART患者中，CD4 T细胞计数和CD4/CD8比值与CXCL11水平呈负相关。CD4⁺T_N和CD8⁺T_N细胞的频率与CXCL11和IL18的水平呈负相关，HLA-DR⁺CD38⁺CD8T细胞的频率和CXCL9的水平呈正相关，PD-1⁺CD4T细胞的数量与SLAMF1和IL18水平呈正相关。此外，我们测量了ART患者的HIV-1 DNA和细胞相关的未剪接RNA。ART治疗患者的HIV-1DNA水平与HIV-1RNA水平呈正相关。在聚类5中检测到HIV-1 DNA与ST1A1、CASP8、SIRT2、AXIN1、STAMBP、CD40和IL7水平之间存在显著的负相关（图5）。CDCP1水平与HIV-1 RNA水平呈正相关（图5）。有趣的是，对IRs和INR中IRP与临床和免疫学变量之间的相关性的评估表明，聚类5中的大多数IRP，包括CXCL5、ST1A1、CASP8、SIRT2、AXIN1、STAMBP和IL7，与IRs中的HIV-1 DNA水平呈负相关，但与INR中的HIV-1DNA水平无关。

图5. 抗逆转录病毒疗法（ART）治疗的HIV-1感染者与HCs之间的炎症相关蛋白（IRPs）差异表达

 

热图显示了差异表达蛋白与临床和免疫学变量之间的Spearman相关性，红色和蓝色分别表示正相关和负相关。

 

为了确定可区分INRs和IRs的IRP，使用多变量线性回归检查了IRs和INRs之间九种显著差异表达的蛋白质，包括CDCP1、OPG、CD5、uPA、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和Flt3L。六个IRP是具有统计学差别的，包括CDCP1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5。受试者操作特征曲线分析表明，这六种蛋白质的评分值为95.06%（图6A）。在六个IRP中，INR中CDCP1、CXCL11、CST5和SLAMF1的水平高于IR，而INR中TRANCE和CD5的水平低于IRs（图6B）。我们还分析了这六种IRP在TNs中的表达，根据低和高CD4T细胞计数和病毒载量将其分为两组。两组之间的IRP没有差异。

图6. 炎症相关蛋白用于区分血浆中的免疫应答者和免疫无应答者

 

（A）六种差异表达的炎症相关蛋白（IRP），包括CDCP-1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5，用于区分INRs和IRs。（B）INRs和IRs中CDCP-1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5的表达水平。数据用中位数表示，两组之间的统计显著性通过非参数、非配对Mann-Whitney U检验确定，AUC表示曲线下面积。

 

此外，我们对IRs和HCs之间的26个差异表达IRP以及INR和HCs中的34个差异表达的IRP进行了GO分析。在前10个生物过程中，细胞对LPS的反应是INRs所明显富集的。一致地，先前的一项研究表明，INRs中的脂多糖（LPS）血浆水平高于IRs。LPS是革兰氏阴性细菌外膜的主要成分，具有高度抗原性。LPS在HIV-1感染期间负责慢性免疫激活和炎症。

 

讨论

 

虽然使用ART成功控制了HIV-1病毒血症，但HIV-1感染者，尤其是INRs人群，仍经历了较高的非艾滋病相关事件发生率，这部分归因于残留的慢性炎症和免疫激活。在这项研究中，我们系统地分析了具有不同疾病状态的HIV-1感染个体的IRP，并分析了这些IRP与T细胞功能障碍和HIV-1疾病进展的关系。我们发现HIV-1感染改变了T细胞分化、活化和耗竭。IRPs的异常表达与HIV-1疾病进展和T细胞功能障碍密切相关（图7）。

图7. 显著改变HIV-1感染个体的炎症相关蛋白及其与免疫恢复的关系

 

HIV-1感染导致炎症相关蛋白（IRPs）的上调，包括CXCL11、CXCL9、TNF、CXCL10、IL18、CDCP1和SLAMF1。虽然进行了抗逆转录病毒治疗（ART），这些IRP仍然异常，特别是在INRs中。重要的是，聚类7中的这些IRP与T细胞分化、活化和耗竭密切相关。

 

在我们的研究中，与IRs相比，INRs年龄更大，基线CD4 T细胞计数更低，这与之前的研究一致，研究表明，年龄更大和基线CD4T细胞计数低与HIV-1感染个体的免疫恢复不良相关。先前的研究表明，T_N细胞随着年龄的增长而减少，并表现出增殖和效应器分化缺陷，进一步导致老年患者的T细胞功能障碍和活化。

 

HIV-1感染诱导的T细胞功能障碍不能通过ART治疗完全恢复，尤其是INRs。与先前研究的结果一致，与IR和HC相比，我们观察到INR中CD4⁺T_N和CD8⁺T_N细胞的频率降低，以及CD4⁺T_EM和CD8⁺T_EM细胞的频率增加。T_N细胞频率降低可能与胸腺输出减少以及T细胞分化为记忆和效应T细胞有关。T_EM细胞可以迁移到发炎的外周组织并发挥效应器功能；然而，T_EM细胞频率的增加可能与INR的过度激活和加速耗竭有关。此外，与HCs和IRs相比，INRs的T细胞活化和耗竭更高。免疫激活的机制是复杂的。肠道微生物转移到血液中是HIV-1感染期间全身免疫激活的一个原因。LPS是一种微生物易位的指标，在HIV-1感染期间显著增加，INRs中的LPS高于IRs。此外，调节性T细胞在抑制T细胞活化和增殖方面发挥着重要作用。然而，HIV-1感染个体的调节性T细胞减少，可能导致异常免疫激活。

 

炎症是HIV-1感染的标志，但IRP与T细胞失调之间的联系尚未完全了解。因此，我们评估了92个IRP的水平，发现聚类7中的CXCL11、CXCL9、TNF、CXCL10、SLAMF1和IL18与T细胞分化、T细胞活化和耗竭以及TNs的疾病进展密切相关。ART后，HCs和TNs之间一些差异表达的IRP仍然异常，特别是聚类7中的蛋白质。特别是，聚类7中的CXCL9、CXCL10和CXCL11与疾病进展和免疫紊乱密切相关。CXCL9，CXCL10，CXCL11是IFN-γ诱导的趋化因子，由单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞分泌，并与细胞表面CXCR3相互作用。这些配体与CXCR3的相互作用影响T细胞向炎症区域的迁移及其向效应T细胞的极化。此外，CXCL9、CXCL10和CXCL11在调节T_N细胞向Th1细胞的分化和免疫激活中发挥重要作用。

 

Th1细胞产生IFN-γ、TNF和IL2，并通过刺激细胞毒性T细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞来促进免疫反应。IL18主要由树突状细胞和巨噬细胞分泌，可能通过驱动IFN-γ分泌影响CXCL9、CXCL10和CXCL11的产生。先前的一项研究表明，CXCL9、CXCL10和CXCL11水平可以预测原发性HIV-1感染期间的HIV-1疾病进展。因此，阻断CXCL9、CXCL10和CXCL11/CXCR3轴显示出作为减少免疫激活和衰竭的途径的潜力。多元回归分析表明，CDCP1、CXCL11、CST5、SLAMF1、TRANCE和CD5的组合可用于区分INRs和IRs。CDCP1是T细胞上表达的CD6的配体，在免疫突触中充当共刺激受体，被认为是治疗恶性肿瘤的分子靶点。如前所述，CXCL11与HIV-1疾病进展相关。

 

CST5编码组织蛋白酶家族几种半胱氨酸蛋白酶的抑制剂，是候选的肿瘤抑制基因。CST5和TRANCE可以抑制破骨细胞的活化和吸收，这可能与HIV-1相关的骨疾病有关。SLAMF1，也称为CD150，在HIV-1感染的免疫抑制中发挥重要作用。急性HIV-1感染患者的T细胞CD150表达降低，这与Th1细胞介导的应答受损相关。CD5被广泛报道参与调节T细胞和B细胞中抗原受体的信号传导。我们发现INRs的CD5水平低于IRs，这可能反映了免疫激活反应能力低下。

我们发现聚类5中的ST1A1、CASP8、SIRT2、AXIN1、STAMBP、CD40和IL7与HIV-1 DNA呈负相关。ST1A1是一种胞浆硫转移酶，调节单核细胞衍生巨噬细胞中HIV-1逆转录。CASP8是一种半胱天冬酶蛋白，是参与激活级联的上游蛋白酶，负责死亡受体诱导的细胞死亡。SIRT2是去乙酰化酶（sirtuin）家族的成员，由NAD⁺依赖性脱乙酰酶组成，参与多种细胞过程。SIRT2可以通过脱乙酰酶p65调节NF-κB信号传导，这可能影响HIV-1潜伏期。AXIN1是WNT信号的调节器，在正常细胞培养条件下，通过WNT信号通路在HIV-1转录中发挥负作用。STAMBP，也称为AMSH，通过负调节NLRP3炎症小体失稳来抑制炎症因子的释放。先前的一项研究报告称，STAMBP的结构失稳导致HIV-1出芽期间功能丧失。

 

CD40，也称为TNFRSF5，与配体CD40L相互作用，通过诱导HIV抑制性趋化因子和支持抗HIV抗体和细胞毒性T细胞的产生，有助于HIV-1复制的免疫控制。IL7对于T细胞存活和外周T细胞的稳态维持至关重要。IL7显著增强HIV-1前病毒再激活。尽管在这些蛋白质和HIV-1 DNA之间观察到了负相关，但它们的因果关系需要进一步调查。此外，我们发现聚类5中的ST1A1、CASP8、SIRT2、AXIN1、STAMBP、CD40和IL7与IRs中的HIV-1 DNA呈负相关，但与INRs中的HIV-1DNA无相关。HIV-1 DNA在具有最佳免疫状态的IRs中相对稳定。然而，INR易受机会性感染的影响。HIV-1在再激活时的免疫监测减弱，再加上感染诱导的免疫激活，可能会影响INR中HIV-1的稳定性。此外，与IRs相比，INRs具有更高水平的HIV-1 DNA和RNA。

 

这项研究有几个局限性。首先，IRP影响T细胞免疫恢复的机制需要进一步分析，因为关联不一定表明因果关系；第二，我们的研究中基于PCR的检测高估了HIV-1的大小，因为它无法区分复制能力和有缺陷的前病毒基因组。最后，由于缺乏样本，我们无法评估T细胞亚群的功能，包括细胞毒性和细胞因子分泌能力，未来的研究需要揭示异常IRP与T细胞功能的关系。

 

总之，在ART治疗的HIV-1感染个体中，炎症和T细胞失调持续存在。无论患者是否接受ART治疗，聚类7中的一些IRP，如CXCL11、CXCL9、TNF、CXCL10和IL18，均与HIV-1疾病进展和免疫紊乱密切相关，这些结果可能有助于确定有效的免疫干预策略。

 

原文链接： 

https://www.tandfonline.com/doi/full/10.1080/22221751.2022.2150566