大肠杆菌蛋白表达系统
2023-06-07 来源:本站 点击次数:751. 代谢途径和基因表达调控机制比较清楚
1) 全基因组测序，共有4405个开放性阅读框架；
2) 基因克隆表达系统成熟完善；
3) 繁殖迅速，培养简单，操作方便，遗传稳定。
2. 培养周期短
1) 大肠杆菌繁殖能力强，在营养条件充足时，20~30mins即可繁殖一代；
2) 大规模发酵成本低，具有巨大的生存潜力。
3. 目标基因表达水平高
表达水平较一般真核表达系统高，某些外源基因在大肠杆菌中的表达量可达总蛋白的5%~30%。
4. 遗传背景清楚
1) 对大肠杆菌的遗传背景和生理特性研究相当清楚，已有多种不同的抗药性、不同营养缺陷型和不同校正突变型的菌株供选择使用；
2) 可以根据不同的载体而选择不同的菌株。
5. 抗污染能力强，下游工艺简单，易于控制。
6. 已有大量可供选择利用的表达载体，被美国FDA批准为安全的基因工程受体菌。
艾柏森生物大肠杆菌表达系统优势1. 艾柏森生物大肠杆菌可溶性表达成功率高达95%；
2. 艾柏森生物可以提供多种大肠杆菌表达载体，pET28b、pET22b、pGEX-6P-1等。
3. 多种大肠杆菌表达宿主，标准表达菌株BL21，可增强表达蛋白的菌株T7E，表达毒性蛋白的C41，增强蛋白可溶性表达的超低温菌株Arctic，以及其他经过艾柏森生物分子技术团队改造过的表达菌株，可以满足客户的不同需求。
4. 表达系统的优化。通过对表达系统进行优化，很大程度上解决蛋白不表达和包涵体的问题，如表达载体与表达菌株相容性测试、诱导表达条件的优化、复性等。
服务组合| 服务项目 (Service Items) | 周期（周） Time(weeks) |
| 蛋白分析与密码子优化 | 项目开始前完成 |
| 基因合成 | 2~4 |
| 载体构建 | 1 |
| 基因表达纯化测试 | 2 |
| 1L发酵表达及纯化 | 2 |
| 切标签 | 2 |
| 大规模的发酵与纯化 | 以项目需要为准 |
| 总计 | 8~10 |
注：
1）表达纯化测试一般包括2种载体，3种表达菌株，2个表达温度，12个条件的测试，根据客户的前期实验结果，有可能调整或缩短试验周期；
2）我们可提供的备选优化条件如下：
| 表达载体 | pET28b\pET32a\pGEX-6p-1\pET22b\pBAD\pTrcHis等 |
| 表达菌株 | Arctic\BL21(DE3)\Origami\Rosetta\T7 Expresss |
| 表达温度 | 16℃\30℃\37℃ |
经典案例
以某原核蛋白为例:
1. 优化表达体系，包括苏朱军、诱导温度、诱导时间、诱导剂浓度及培养基。
| 宿主菌 | 诱导温度 | 诱导时间 | 诱导剂 | 培养基 |
| T7E，BL21,C41,Arctic | 30℃/37℃ | 1h/4h | IPTG自诱导 | LB/定制/同位素/自诱导 |
经过3轮优化，我们选择了BL21+pGEX-6p-1组合，并发现温度对与目标蛋白的表达影响最大，如图一
图一:融合蛋白小试SDS-PAGE分析图
M:ProteinMarker；：诱导前总蛋白；
2：20℃上清；3：20℃沉淀；4：37℃上清；5：37℃沉淀。
2. 在确定了最优表达条件后，我们对蛋白进行了GST琼脂糖亲和层析尝试纯化，如图二，
图二：GST琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE分析图
M：Protein marker；S：上样；F：流出；1：20mM GSH洗脱组分；
3. 在确定纯化效率可以接受的条件下，我们对蛋白进行了大体积发酵，并最终纯化SDS-PAGE分析，如图三，融合蛋白经过纯化，SDS-PAGE电泳分析在相应位置出现明显条带，表明目的蛋白成功得到了纯化。
图三：蛋白最终纯化SDS-PAGE分析图
M：Protein marker；1：目的蛋白
4. 蛋白浓度测定
采用SK3071 非干扰型蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度为1.06mg/mL，待测样品体积为10μL，结果如下：
| 测试1 | 测试2 | 平均值 | BSA（μg） |
| 0.939 | 0.939 | 0.939 | 0 |
| 0.875 | 0.874 | 0.8745 | 8 |
| 0.808 | 0.804 | 0.806 | 16 |
| 0.74 | 0.746 | 0.743 | 24 |
| 0.618 | 0.616 | 0.617 | 40 |
| 0.855 | 0.849 | 0.852 | 50 |
| 0.891 | 0.878 | 0.8845 | 目的蛋白 |
图四：蛋白浓度测定
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