摘要

重组蛋白质生产的目标是产生高产量的功能性蛋白质。实验成功的重要基础是细胞的培养以及离心（离心是蛋白质分离和纯化的基本技术）。本应用指南描述了用作概念系统验证的重组人磷酸丝氨酸磷酸酶（hPSP）的生产流程。从Innova® S44i 摇床中细菌培养物的生长开始，使用装载 6 L转子的高速离心机（CR30NX 或 CR22N），搭配 1.5 L 三角离心瓶收获这些培养物。该离心收获套装可辅以“ 锥底管高速沉淀离心套件 ”（转子含配套的 50 mL 锥底管），用于裂解后续的分离操作。结果表明，这种产品组合高效灵活，可为重组蛋白大规模生产工作流程奠定基础。

前言

重组蛋白的生产是一项基本的生物技术，已应用于研究、医学和工业领域。这些蛋白质由转基因生物所产生。根据蛋白质的类型及其用途，可以使用许多不同的表达系统（例如细菌、酵母、哺乳动物细胞、昆虫细胞）。

在此过程中，所需的 DNA 序列（编码蛋白质的遗传信息）通过分子克隆被引入宿主生物体。在选择表达重组蛋白的克隆后，对其进行培养。第一步，细胞繁殖，第二步，诱导基因表达。通常会结合使用多种不同技术来分离和纯化所需的蛋白质。最初，通过破碎细胞来分离蛋白质与其他细胞成分（裂解）。然后利用其特性将靶蛋白与细胞的剩余蛋白分离，随后进行富集。

特别是如果需要对未知蛋白进行表征（即需要研究其结构和功能），那么需要目标产物的数量会更多。尤其是两个步骤会受此影响：必须扩大细胞培养和收获的规模（数升）。这对用于回收目标产物的仪器设备会提出更高的要求，同时也会导致更高的工作量（如果采用体量较小的设备）。

因为易于被基因改造且培养速度很快，细菌大肠杆菌成为了一种普遍的表达系统。为了使得细胞生长足够且蛋白质表达充分，需要一台能够以升为规模对培养物进行高速振荡的稳健摇床。重组蛋白生产中的另一项重要技术是离心，因为它通常涉及多个步骤。离心的目的在于收获细胞、澄清细胞裂解物和（如有必要）浓缩蛋白质溶液（图 1）。离心过程中必须考虑以下要求：由于每个离心容器都需要大量手动操作步骤，收获几升培养物就变得非常耗时 (1)。一方面是培养体积会变化，另一方面体积较小就需要额外增加离心次数，而且用于分离、纯化和浓缩蛋白质的参数又不同，这样一来就需要额外使用离心容器、转子等设备，及其他可能需要的装置。


本应用指南阐述了通过培养和收获细菌以及纯化蛋白质来生产重组蛋白的工作流程。目的是证明使用 Innova S44i 摇床和高速落地离心机 CR30NX 可以获得高产的功能性重组蛋白。为此，我们使用了离心收获套装，并辅以高速沉淀离心套件。这种搭配可以帮助用户轻松且有效地执行工艺流程的每一个步骤。
 
材料

表达系统
用 pET28a 质粒转化大肠杆菌 BL21（DE3），该质粒含有编码带 His 标签蛋白的人磷酸丝氨酸磷酸酶（hPSP）基因（图 2）。

培养系统
为了培养细菌，使用了 Innova S44i 摇床（冷冻型，轨道直径2.5 cm）。该恒温摇床容量大，可以高速高效振荡大量培养物。因此，它非常适合以升为规模对培养物进行培养。

离心系统
高速落地离心机 CR30NX 可与独特的 6 L 转子（R9A2 固定角转）组合使用，也可匹配 1.5L 三角瓶，即上文提到的专为收获大量培养物而设计的离心收获套装（图 3）。该系统辅以高速沉淀离心套件，该套件由 R19A2 固定角转以及 50 mL 锥底管组成。

也可以使用 Centrifuge CR22N。为此，我们也提供相应的离心收获套装和补充套件
  图3：A) 高速落地离心机CR30NX，B) 高速落地离心机 CR22N，C) R9A2固定角转（4 x 1.5 L转子），带1500 mL三角瓶，D) R19A2固定角转，带50 mL锥底管

方法

细菌增殖和诱导：
初始培养：向装有 50 mL 培养基的 250 mL 培养瓶中加入50 µL 大肠杆菌（溶于甘油，含 pET28a）。将培养瓶放在Innova S44i 摇床中过夜培养（转速 300 rpm，温度 37 °C），直到 OD600 达到 15-25。准备 3 个摇瓶进行诱导培养：向装有1 L 培养基的 2.5 L 培养瓶中加入 5 mL 初始培养物。将培养瓶在 S44i 摇床中培养（转速 250 rpm，温度 37 °C ），直到OD600 达到约 2.0（约 4-5 小时）。加入 10 mL IPTG 后，在 37 °C 下以 250 rpm 的转速继续培养 3 小时。

收获
在诱导结束时，将悬浮液回收在两个 1.5 L 三角瓶（预先称重）中，在装有 R9A2 固定角转的高速落地离心机 CR30NX 中以4,000 rpm 的转速在 4°C 下离心（7,100 x g）30 分钟。弃去上清液。（在添加细胞培养悬浮液之前和离心之后对瓶子称重，获得沉淀的重量）。

裂解 
每克细菌沉淀中添加 20 mL 裂解缓冲液，然后用血清移液管重新悬浮。在室温或 4°C 下搅拌 30 分钟后，将悬浮液置于冰上超声处理 10 分钟（15 秒开， 45 秒关，10 次循环）。然后使用 50 mL 锥底管在高速落地离心机 CR30NX 和 R19A2 固定角转中以 12,500 rpm（32,900 x g）在 4 °C 下离心 1 小时，从而澄清裂解物。回收上清液并经 0.2 µm 过滤器过滤。

亲和层析纯化
用 3 到 5 倍柱体积的蒸馏水洗涤 HisTrap® FFcrude 层析柱，再用至少 5 倍柱体积的结合缓冲液进行平衡。持续搅拌400mL 澄清裂解液的同时，将其以 10mL/min 的流速缓慢加入层析柱。用结合缓冲液清洗层析柱，直至吸光度达到稳定的基线（约 15 个柱体积）。通过一步操作完成洗脱：前 10 个组分用 20% 咪唑的洗脱缓冲液收集，而后 10 个组分用 100 %咪唑的洗脱缓冲液以 5 mL/ 组分 / 分钟的流速收集。

浓缩
由于初步测试表明蛋白质溶液浓度足够高，因此未进行浓缩。

分析
> 总蛋白的吸光度法定量（通过测量 280 nm 处的吸光度）。
> 在还原和变性条件下通过 4-12 %SDS-Page 电泳和考马斯亮蓝染色来鉴定蛋白质。
> 通过孔雀绿磷酸盐测定法测量酶活性。

结果与讨论

使用 20 % 咪唑洗脱缓冲液从亲和柱中获得总共 10 个组分。这部分旨在去除杂质。随后用 100 % 咪唑的缓冲液洗脱 10个组分，目的是回收纯化的蛋白质。为了鉴别相关组分，测量了它们在 280 nm 处的吸光度。

图 4 显示了吸光度测量的结果，显示了每个洗脱组分的总蛋白质浓度的信息。可以清楚地看到， 100 % 咪唑洗脱缓冲液从柱中溶解下来了大部分蛋白质。其中蛋白质比例最高的位于100 % 咪唑洗脱的第二个组分中（= 组分 12）。
 
为了确定靶蛋白人磷酸丝氨酸磷酸酶是否存在于各个组分中，存在的量以及它是否具有功能性，通过 SDS PAGE 对各个组分进行了分离，然后进行孔雀绿磷酸盐测定，从而测量酶活性。用考马斯亮蓝染色的 SDS 凝胶证实大量蛋白质从组分 11 开始逐渐被洗脱下来（用 100 % 咪唑洗脱开始）（图 5）。显示最高蛋白密度的条带位置暨为靶蛋白 hPSP，其大小为 25 kDa。污染物在开始时被 20 % 咪唑缓冲液洗脱下来。
 
孔雀绿磷酸盐测定法是一种比色法，可通过释放的磷酸盐量来测定磷酸酶的活性。测定结果表明，大量功能性hPSP被含100 %咪唑的洗脱缓冲液洗出，与吸光度测量结果一致，最大酶活位于组分12处。（图6）。
 
结果表明，Innova S44i 摇床和高速落地离心机 CR30NX 以及上述实验配件可以成功地用于高产率的重组蛋白的生产和纯化。凭借其稳健的设计和高容量，Innova S44i 摇床能够高效地培养微生物，即使是大量培养物其也能应对自如 (2)。上述种种均是实现细胞旺盛生长和蛋白高表达的基本要求。

高速落地离心机 CR30NX 和 CR22N 配备众多转子和离心管（包括可用于放大选项的连续流转子），用途非常多样。由 4 x 1.5L 转子和相应的 1.5 L 三角瓶组成的离心收获套装是用于收获细胞的最佳搭配。1.5 L 独特的三角形设计可以轻松实现沉淀物再悬浮、上清液回收和瓶身的清洁。此外，单个瓶便可处理 1.5L 培养物，节省了每个处理步骤的时间，包括：灌装、平衡、封瓶、转子装载、倾倒、颗粒再悬浮和回收，以及每个瓶子的清洗。第 64 号白皮书中提到，与处理 6 个 1 L 容量的瓶子（6 x 1 L 转子标配）相比，使用 1.5 L 离心瓶可以节省 32 % 的处理时间 (1)。还有一点揭示了该系统的高度灵活性：1.5L 三角瓶可不受最小装液量的限制（传统离心瓶就会受此限制）。

根据应用情景的不同，可以额外搭配离心套件（转子和离心管的组合）来对本离心收获套装进行扩展。只需要另外使用一个离心套件（锥底管高速沉淀套件）即可涵盖从收获到浓缩生产重组蛋白的所有离心步骤。这意味着Innova S44i摇床和高速落地离心机可以应用于细胞培养、收获和后续纯化的全流程步骤。

结论

本应用指南展示了成功使用Innova S44i摇床和高速落地离心机 CR30NX（包括转子和容器）来生产重组蛋白的流程。除了具备产量高且功能经过验证的优点，各个实验步骤的执行也十分高效。这得益于产品之间的组合使用使得各自的配件实现了彼此间功能的互补，为实验流程提供了基本的框架支撑。特别值得一提的是，独特的1.5 L三角瓶以及灵活的离心收获套装/套件组合使得操作方便且省时，为多种应用场景提供了简明的解决方案。


Acknowledgement
We thank Professor Johan Wouters (Laboratoire de Chimie Biologique Structurale (CBS), Namur Medicine and Drug Innovation Center (NAMEDIC), Namur Research Institute for Life Sciences (NARILIS), University of Namur (UNamur), B-5000 Namur, Belgium) for providing the hPSP plasmid.

Literature 
[1] Tacheny A. Unique 4 x 1.5 L Capacity Rotor for High-Speed Centrifuges CR22N and CR30NX, Eppendorf White Paper No. 64
[2] Hartmann I, Jarvis J. The New Eppendorf X-Drive – Maximum Performance, Flexibility and Longevity for Demanding Shaker Tasks. Eppendorf White Paper No. 47

Application Note No. 451, 附录 1: 材料与方法补充细节

材料
试剂

SRAM 培养基：
>100 mM MOPS 缓冲液，pH 7.4，含 24 g/L 酵母提取物，16 g/L 胰蛋白胨，10 g/L 酪蛋白水解物和 10 mL/L 甘油（100 %）
> 高压灭菌
> 加入 500μL/L 消泡剂 204 10 % 和 2.5 mL/L 卡那霉素溶液（10 mg/mL，溶剂为 0.9 % NaCl）。
1 mM IPTG 溶液（最终浓度）

裂解缓冲液：
> 0.2 g/L 溶菌酶溶液，3000 U/L Benzonase® 核酸酶，1mM MgCl2，20 片 /L cOmplete™，不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物溶于结合缓冲液

结合缓冲液：
> 100 mM NaCl，25 mM HEPES，10 mM 咪唑溶于分子生物学级水
> 调节pH 至 7.4
>使用前经 0.22μM 过滤器过滤

洗脱缓冲液（100 % 和 20 % 咪唑）：
> 100 mM NaCl，25 mM HEPES，250 mM 咪唑（100 %）或 50 mM 咪唑（20 %）溶于分子生物学级水
> 调节pH 至 7.4
>使用前经 0.22μM 过滤器过滤

耗材
> Ultra Yield® 250 mL 和 2.5 L 无菌培养瓶（Thomson）
> AirOtop™ Enhanced Seals 透气盖，适用于 Ultra Yield® 250 mL 无菌专利培养瓶（Thomson）和 2.5 L无菌专利培养瓶（Thomson）
> HisTrap® FF crude 5 mL 预装柱（GE Healthcare）

设备
> Watson Marlow 323 dz 蠕动泵
> Q500 超声波破碎仪，带 ½" 探头（QSonica®）
> NanoDrop® ND 2000 超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific）
> xMark 微孔板分光光度计（BioRad®）

方法

光度分析
通过测量 280 nm 处的吸光度，进行总蛋白吸光度定量。

SDS PAGE 电泳和 Coomassie Blue® 染色
通过用考马斯亮蓝染色的 4-12% SDS-PAGE 验证蛋白质 hPSP 的纯度，同时确定不同组分中是否存在污染物。按照 NuPAGE® 技术指南（Thermo）制备用于还原和变性条件下的凝胶电泳的样品和缓冲液制剂。将 4.37 μL NuPAGE LDS 样品缓冲液和 1.75 μL NuPAGE 样品还原剂添加到 11.4 μL 样品中（分别取自每个组分）。将混合物在 70°C 下加热 10 分钟，以完成还原和变性，然后将每个样品（16 μL）上样到 NuPAGE 4-12% bis-Tris 蛋白凝胶（1.0 mm，10 孔（Thermo））的孔中。蛋白质分子量标记物已上样到每个凝胶中。凝胶在 XCell SureLock® 小型电泳槽（Thermo）和 NuPAGE MES SDS 电泳缓冲液（Thermo）中以 200 V 恒定电压运行，电流：初始电流：125 mA/ 凝胶，终末电流：70-80 mA/ 凝胶，持续 35 分钟。电泳后，在振荡器上以 60 rpm 的震荡速度用去离子水将凝胶清洗 15 分钟。使用 GelCode®Blue Safe 染色剂（Thermo）在室温下以 60 rpm 的搅拌速度对蛋白进行染色 1 小时。在扫描前，用超纯水代替染色试剂，以 60 rpm 的震荡速度在室温下将凝胶漂洗脱色 2 小时。

酶活性测定
使用孔雀绿磷酸盐分析试剂盒（Sigma）测定磷酸盐含量来鉴定酶活性。当酶促反应产生无机磷酸盐时，该方法可使用孔雀绿来对在620 nm 处形成的磷钼酸盐进行定量。96 孔板中每孔 80 μL 样品。每孔加入 20 μL 工作试剂。将样品在室温下孵育 30 分钟，让其显色。然后用酶标仪在 620 nm 处测量吸光度。