稳定细胞株筛选具体方法过程
2023-12-05 来源:本站 点击次数:360
稳定细胞株已广泛应用于重组蛋白、抗体生产、检测分析、免疫治疗药物开发等研究领域。表达的蛋白/抗体稳定性更好，批次间差异小，是生物医药研发的基础。有时候，为了满足细胞需求，我们会构建稳定细胞株而不是瞬时转染。相对瞬时转染而言，稳定转染是指进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
稳定细胞株筛选：
方法一：
先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，单克隆筛选稳定细胞株。
第一步：筛选浓度测定，以10~14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度；
第二步：进行细胞接种，转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80% 覆盖；
第三步：进行细胞转染
第四步：利用质粒上含有的抗性选择进行筛选，并鉴定筛选结果。
方法二：
应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。慢病毒可以携带外源基因随机整合进基因组。转染得到稳定细胞株的效率高，是建立稳定株的方式。
第一步：将人源化的抗体基因转接到慢病毒载体上，
第二步：使用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，不同类型病毒包装时间一般在3-5天。
第三步：用病毒转染目的细胞。包装好的病毒要先测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。
第四步：后期筛选。转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。
稳定细胞株筛选：
方法一：
先把质粒整合到染色体上后，用相应的质粒DNA中的抗性标志来筛选该细胞系，单克隆筛选稳定细胞株。
第一步：筛选浓度测定，以10~14 天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度；
第二步：进行细胞接种，转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80% 覆盖；
第三步：进行细胞转染
第四步：利用质粒上含有的抗性选择进行筛选，并鉴定筛选结果。
方法二：
应用逆转录病毒，慢病毒转染，筛选稳定细胞株。慢病毒可以携带外源基因随机整合进基因组。转染得到稳定细胞株的效率高，是建立稳定株的方式。
第一步：将人源化的抗体基因转接到慢病毒载体上，
第二步：使用包装细胞，一般为293细胞，包装出病毒，不同类型病毒包装时间一般在3-5天。
第三步：用病毒转染目的细胞。包装好的病毒要先测滴度，根据滴度决定转染目的细胞的病毒量。
第四步：后期筛选。转染目的细胞1-2天后加抗生素筛选得到稳定细胞株。
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