当培养细胞增殖达到一定密度（70%-80%）后，将会出现密度抑制现象，表现为细胞的生长和分裂速度逐渐减慢，甚至停止。贴壁细胞会在培养瓶中长成致密单层（悬浮细胞会充满整个体积的培养液），并铺满培养瓶底部，如果不及时进行分瓶处理，细胞将会逐渐走向衰老、死亡。

而将培养的细胞从一个容器以适当比率转移到其他容器中进行扩大培养，称为细胞传代。

一：细胞传代目的

1、 完成细胞数量的扩增。

2、 避免因细胞进入平台期或衰亡期，而发生大量死亡。

二：细胞传代步骤参考（以T25瓶为例）

 

贴 壁 细 胞

1、吸去培养液：取对数生长期的贴壁细胞（细胞融合度70%-80%）。吸去培养上清液，用不含钙、镁离子的PBS 2 mL润洗细胞1-2次。

细胞融合度判断参考图
 

2、加消化液：加1 mL胰酶消化液于培养瓶中，盖好瓶盖，使胰酶消化液均匀地浸润细胞表面，置于37℃培养箱中消化1-2分钟。

3、消化观察：期间可在显微镜下观察细胞消化情况，当细胞大部分变圆并脱落，准备终止消化。

4、加培养基终止消化：加入3-4 mL完全培养基终止消化，缓慢吹打细胞悬液，转移到离心管中。

5、离心：将细胞悬液放入离心机配平，进行离心（800-1000 rpm，3-5 min）。

6、弃上清：去掉细胞上清液。

7、重悬细胞：用新鲜的培养基重悬细胞，接种到新的培养器皿中。

8、分装：根据细胞生长特性和后续的实验要求，进行分装传代的操作。

 

悬 浮 细 胞

1、收集：轻轻吹散悬浮细胞，部分贴壁松散的悬浮细胞可直接吹打培养瓶底部使细胞悬浮，收集细胞悬液到无菌离心管中。

2、离心弃上清：按离心800-1000 rpm，3-5 min，进行操作，离心完吸出上清摒弃。

3、接种传代：加入适量新鲜培养基重悬细胞，按比例接种至培养瓶（接种比例按实际情况，不确定可计数后再接种），常规细胞推荐以3-5*10^5 cells/mL传代。

 

半 贴 半 悬  细 胞

1、收集悬浮细胞：用移液器吸出培养液转移到无菌离心管中（悬浮细胞部分）。

2、收集贴壁细胞：用1 mL PBS清洗细胞，吸出后放入上述离心管中（贴壁细胞部分）。

3、加消化液：培养瓶中加入1 mL 胰酶消化液，放入培养箱中静置消化。

4、消化观察：消化的时间依据细胞本身特性，可边消化边观察，细胞大部分脱落或变圆，即可终止消化，全程不要拍打培养瓶。

5、接种传代：按照适当的比例接种新的培养瓶进行传代培养。

三：细胞传代注意事项

 

1、牢记无菌意识；

2、把握传代时机，对数增长期或细胞融合度达到70%-80%进行传代；

3、均匀消化，减少细胞团块的形成；

4、吹打过程动作的轻柔，避免产生气泡；

5、适度消化；

6、传代比例合适，避免细胞传代频繁或代次紊乱；

7、使用一次性移液管，避免交叉污染。

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