在肿瘤演化过程中，肿瘤始于单个或多个细胞的转化，这些细胞通过随机的突变形成克隆扩增，进而积累更多突变实现恶性转化。但仅有少数克隆能转化为恶性肿瘤，其背后的机制尚不清楚。

为了解答这一疑问，苏黎世大学以及苏黎世联邦理工学院的联合研究团队开发了一种 CRISPR 策略，系统地记录了在胚胎阶段中的克隆扩情况，并揭示了肿瘤发生与克隆扩增密切的分子过程，相关内容以 In vivo single-cell CRISPR uncovers distinct TNF programmes in tumour evolution 为题发表于 Nature。
 

驱动克隆扩增的突变集中于TNF信号通路
研究人员首先对 CROP-seq 系统进行了调整，将基因盒中的puromycin替换为mCherry荧光标记，并使用 TargetMol 的 5-ethynyl-2′-deoxyuridine（EdU）作为细胞增殖标记物，通过荧光激活细胞分选（FACS）选择感染的细胞，从而实现对基因干扰的监测和分析。然后通过子宫内病毒微注射、单细胞 RNA 测序和导向捕获（guide capture）等技术，系统地研究了 150 个常见的癌基因在克隆扩增和肿瘤发生中的作用。

在进行基因干扰后，对小鼠进行长期观察，并收集样本进行单细胞 RNA 测序。通过计算每个基因干扰对小鼠的表皮干细胞（EpSCs）的差异基因表达，发现许多 驱动克隆扩增的突变与肿瘤坏死因子（TNF）信号通路的基因表达高度相关。

例如，在 P60（小鼠出生后60天）细胞群的 44 个基因模块中，占主导地位的一个主要基因模块就包含了 25 个与 TNF 信号相关的基因。
 

▲上皮细胞的克隆扩增集中于TNF信号通路

小贴士
TNF 信号主要通过 TNF 配体与 TNF 受体1（TNFR1）结合激活，涉及 JUN 和 NF-κB 等转录因子。这些转录因子在细胞生长、免疫反应和应激反应等多种生物过程中发挥重要作用。

为了测试 TNF 通路在上皮克隆扩增中的作用，研究人员使用超声引导的子宫内病毒微注射在胚胎中靶向 150 个癌基因，随后，比较了在野生型和 Tnfrsf1a^+/− 小鼠 P60 皮肤中的扩张率。

结果显示，在 P60 小鼠皮肤中，TNFR1 主要在 EpSCs 和毛囊干细胞中表达，几乎所有的克隆扩增都高度依赖于 TNFR1，且高表达TNF基因模块的克隆扩增率较高。

而 TNF 主要由巨噬细胞分泌，尽管在后天阶段巨噬细胞的去除并未完全阻止克隆扩增，但它们在表皮的克隆扩增中起到了重要的促进作用。这表明巨噬细胞可能是 TNF 的一个重要来源。
 

▲克隆扩增是通过TNF介导的

自分泌的TNF基因程序
接下来，研究人员测试了 TNF 通路在克隆扩增与肿瘤演化中的作用。

通过在小鼠模型中注射靶向 150 个癌基因的 sgRNA 库，并在特定时间点（P60）进行化学致癌处理，观察肿瘤的形成和发展。然后使用单细胞RNA测序分析，识别出不同的肿瘤细胞群体，发现在 克隆扩增向肿瘤发生的转变过程中，肿瘤细胞会下调用于克隆扩增的TNF模块，并切换到自分泌TNF-MMP9和MMP10轴，促进上皮-间质转化（EMT）的进展，使得肿瘤变得更具侵袭性。并且 TNF 特征与鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma, SCC）患者的较短总体生存期相关。
 

▲癌细胞切换到自分泌的TNF基因程序

小结
综上，该研究建立了一个体内单细胞 CRISPR 平台，系统地解析了常见的 150 种癌基因在在克隆扩增和肿瘤发生中的作用。发现 肿瘤坏死因子（TNF）信号通路是介导克隆扩增的癌症易感性的重要因素。

研究发现部分由巨噬细胞来源的 TNF 刺激的表皮干细胞（EpSCs）中的 TNF 信号基因模块，是表型正常皮肤中克隆扩增的通用驱动因素。而在从克隆扩增到肿瘤发生的过渡过程中，这一信号模块被下调，侵袭性癌细胞转向一种与基质重塑因子如 MMP9 和 MMP10 相关的自分泌 TNF 基因程序，以促进与上皮-间质转化相关的侵袭性特性。为开发新的癌症预防和治疗策略提供了基础。
 

肿瘤进化中不同的TNF程序模型

科研助力

肿瘤坏死因子（TNF）是一种细胞信号蛋白（细胞因子），参与系统性炎症，并且是急性期反应中的细胞因子之一。它主要由活化的巨噬细胞产生，但也可以由许多其他细胞类型产生，如CD4+淋巴细胞、NK细胞、中性粒细胞等。当下，TNF相关研究如火如荼，TargetMol可提供多种TNF相关抑制剂、化合物库以及重组蛋白助力相关研究，欢迎咨询~

原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-024-07663-y