双特异性抗体（Bispecific Antibody, BsAb）是一种通过基因重组技术创造的人工抗体，具备同时特异性地靶向并结合两个不同抗原或抗原表位的能力。

凭借其独特的特异性和双功能性特点，BsAb类药物已成为生物制药研究领域的焦点，特别是在肿瘤治疗、炎症性疾病及自身免疫性疾病等多个医疗领域，展现出了极为广阔的应用潜力和前景。

双特异性抗体（BsAbs）的众多下游工艺开发策略，很大程度上借鉴并扩展了单克隆抗体（mAbs）已经确立的纯化方法。这一做法的合理性在于，BsAbs与mAbs之间确实存在着若干结构上的共通之处，使得mAbs的优化纯化流程成为探索BsAbs纯化工艺的理想起点。

Fig.1 免疫球蛋白G（IgG）单克隆抗体（mAb）以及主要的亲和配体结合位点示意图

Fig.1清晰地描绘了免疫球蛋白G（IgG）型单克隆抗体（mAb）的结构组成。该抗体由两条重链（HC）和两条轻链（LC）相互交织而成。

具体来说，重链（HC）包含了可变重链区（VH）、恒定区1（CH1）、铰链区、恒定区2（CH2）以及恒定区3（CH3）等多个结构域；而轻链（LC）则包括可变轻链区（VL）和恒定轻链区（CL）。其中，VL与VH结构域配对形成抗体的可变片段（Fv），而VL、VH、CL与CH1结构域共同构成了抗原结合片段（Fab），这是抗体与抗原相互识别的关键区域。另一方面，CH2与CH3结构域则联合组成了抗体的可结晶片段（Fc）区域。该区域负责抗体的效应功能，如与免疫细胞或补体系统的相互作用。

Fig.1还特别指出了IgG分子上主要的亲和配体结合位点。这些位点以箭头的形式标记，是设计纯化策略时需要重点考虑的因素。通过对这些结构细节和结合位点的了解，研究人员能够更有效地开发出针对BsAbs的纯化工艺，从而实现高效、高纯度的抗体生产。

根据BsAb的结构，主要可以将其分为三大类，即（i）非对称型，（ii）对称型和（iii）基于片段的BsAbs。它们的结构特性对它们的下游纯化策略具有重要意义^[1]。其分类主要基于Fig.2展示的三种主要形式：

（i）非对称型双抗：这种类型的双抗通常具有衍生自两种不同亲本mAb的重链和轻链。其中轻链和/或重链的部分或全部也可以设计为在可能的情况下在两个臂上相等，以最大限度地减少错误配对。 

（ii）对称型双抗：对称型双抗同样包含Fc片段，其两侧的结构域序列呈现对称性，通过附加到抗体上的额外抗原识别结构域如scFv来实现多重特异性。

（iii）基于片段的双抗：这类双抗由可变区通过不同的连接方式构成，例如BiTE结构（一个scFv的VH与其自身的VL相连，同时也与另一个scFv的VL相连）和Diabody结构（两个scFv不与其自身的VL和VH相连，而是分别与对方的VH和VL相连）。

Fig.2 双特异性抗体的三种主要结构
 

双特异性抗体的设计复杂性经常伴随着多种副产物的产生，这些副产物极大地增加了后续纯化步骤的挑战性。以下是对几种主要副产物及其形成原因的分析：

在细胞培养过程中，由于多种重链（HC）和轻链（LC）的共表达，双抗容易发生HC和LC的错配现象，导致大量具有相似大小和性质的非功能性或单特异性抗体的产生，也称为同源二聚体。

为了减少错配，可以通过分子设计来提高目标双抗的形成概率。例如，广泛应用的Knob-into-Hole（KiH）技术，但同源二聚化仍不能被完全消除。

缺失HC或LC的双抗片段是常见的副产物，例如1/2 BsAb（缺少一条HC和一条LC）和3/4 BsAb（缺少一条LC）。

双抗分子的结构比较复杂，形式多样，而且分子结构特殊，易受到各种物理、化学和细胞生长压力的影响而产生聚集体。

研究表明，基于片段的BsAb由于Fc区的缺失，比传统的IgG更容易形成聚集体。对称型BsAb也被观察到具有较高的聚集体倾向（聚集体比例高达50%）。这种倾向可能部分由于链长度和灵活性的增加，导致分子间结构域更容易发生交换。
 

同源二聚体与双抗分子的物理化学性质都十分的相似，因此需要结合目标双抗分子与同源二聚体之间的结构、亲和力、电荷性质及疏水性的差异来制定纯化策略。

以下为亲和、离子交换和复合模式层析方法对同源二聚体进行分离的具体案例。

Protein A可以特异性地结合IgG1或IgG4的Fc区域。通过改变重链与Protein A的结合能力，可以利用Protein A与同源二聚体之间的结合差异来去除同源二聚体。而不同轻链的设计可避免重链错配，依据同源二聚体与完整抗体在Kappa轻链结构上的亲和力差异，使用Protein L填料实现同源二聚体的有效分离。

利用目标双抗与同源二聚体之间pI的差异，使用离子交换层析进行分离。文献报道^[2]的案例中通过质谱确认了目标BsAb的pI为7.24，同源二聚体的pI为8.04。使用Diamond Q（阴离子填料）类型填料，在选定的上样、淋洗条件（pH7.5和电导率5mS/cm）和上样载量（80mg/mL）下运行，带正电荷的同源二聚体从层析填料上流穿，实现了与目标分子的良好分离。

MMC在离子相互作用的基础上，另外具备了疏水、氢键和嗜硫作用，可利用同源二聚体与目标双抗在疏水性以及表面电荷上的差异对其进行去除。

文献报道^[3]的案例中，使用Diamond MMC Mustang（阳离子复合填料）类型填料，在选定的上样条件（即pH5.5和电导率5mS/cm）和上样载量（30mg/mL）下运行，通过优化淋洗步骤，将淋洗条件优化为50mM His-HCl, 63mM NaCl, pH6.5，可以有效去除半抗和Knob-Knob同源二聚体。虽然Knob-Knob同二聚体结合比半抗体略强，但比靶BsAb弱得多，仍然可以在淋洗步骤被去除。

半抗体是双抗分子组装过程一种常见的副产物，是由于部分重链或轻链过表达，并且由于空间位阻等原因无法形成同源二聚体而产生的杂质。3/4抗体则主要是由于二硫键断裂导致双抗分子的一条轻链缺失所产生的杂质。

以下为通过亲和、复合模式、离子交换层析方法对半抗、3/4抗等低分子量片段进行分离的具体案例。

半抗仅含一个Fc区，相较于含两个Fc区域的目标抗体分子来说，半抗与亲和填料结合能力弱，比目标分子更早洗脱，可通过pH线性梯度或等度pH洗脱去除。

MIX-A除了阴离子作用外，还具有疏水及氢键作用，可有效去除聚体、DNA、宿主蛋白、内毒素、Protein A等杂质。

在测试的对称型双抗案例中，使用Diamond MIX-A Mustang（阴离子复合填料），在选定的上样条件（pH7.0）和上样载量（30mg/mL）下运行，通过优化淋洗步骤，将淋洗条件优化为20mM PB, 0.3M Arg-Cl, pH7.0，可以有效地去除ScFv缺失的副产物，且不会淋洗出目的蛋白，洗脱产品SEC纯度提高了8%。

利用目标双抗与低分子量片段之间所带电荷的差异，使用离子交换层析通过pH或者盐梯度进行分离。

在测试的双抗案例中，BsAb的pI为7.7，使用MegaPloy BXS（阳离子填料），在选定的上样条件（pH6.0）和上样载量（60mg/mL）下运行，洗脱步骤使用A: 20mM Citrate-Na, pH6.0和B: 20mM Citrate-Na, 0.3M NaCl, pH6.0, 进行0~100% B线性梯度洗脱。层析图谱上发现低分子量的片段在洗脱峰尾出现了单独的第二个较小的洗脱峰，通过SEC-HPLC和NR CE-SDS检测，发现收集产品SEC提高了8.7%，CE-NR提高了10.5%，说明片段被明显去除。

在测试的相同双抗案例中，使用Diamond CD-S（阳离子填料），在选定的上样条件（pH6.0）和上样载量（60mg/mL）下运行，洗脱步骤使用A: 20mM Citrate-Na, pH6.0和B: 20mM Citrate-Na, 0.3M NaCl, pH6.0, 进行0~100% B线性梯度洗脱。层析图谱上发现低分子量的片段在洗脱峰尾同样出现了单独的第二个较小的洗脱峰，通过SEC-HPLC和NR CE-SDS检测，发现收集产品SEC提高了7.3%，CE-NR提高了11.0%，说明片段同样能够被Diamond CD-S有效去除。

在双特异性抗体生产过程中，由于肽链的延伸提高了肽链的长度和灵活性，加剧了分子间的肽链缠绕，使得聚集体极易形成。此外，亲和层析低pH洗脱条件也容易造成聚集体的形成。

以下为通过疏水和复合模式层析方法对高分子量聚集体进行分离的具体案例。

疏水层析在去除聚集体上效果突出。聚集体的疏水性比单体强，疏水层析可通过目标分子流穿模式去除聚集体。对于自身疏水性很强的目标分子可选用疏水性相对较弱的Octyl、Butyl填料筛选上样条件，也可选用高分辨疏水填料进行洗脱分离聚体和目标抗体。

文献报道^[4]的案例中，目标产品为对称型双抗，首先使用Phenyl Bestarose HP（疏水填料）类型填料进行常规的递减硫酸钠梯度洗脱，以确定基线纯度和回收率水平。在pH8下，使用递减的硫酸钠线性梯度（0.4~0M）进行洗脱，层析图谱上发现洗脱峰分离效果不明显，收集产品在SEC大于99%的纯度下，收率仅为35.7%。通过优化后的洗脱条件，在使用递减的硫酸钠线性梯度（0.4~0M）上叠加递增的精氨酸（0~1M）线性梯度，层析图谱上洗脱峰出现明显的拖尾，同时收集产品在SEC大于99%的纯度下，收率为81.7%，提高了46%，说明聚集体与目标产品明显分离。

Diamond MMC Mustang在双抗的精纯上应用非常广泛，对降解片段、电荷异构体以及聚集体等副产品有较好的去除效果。

文献报道^[5]的案例中，目标产品为非对称型双抗，使用Diamond MMC Mustang（复合模式填料），在选定的上样条件（硫酸铵浓度调节到1M，pH7.0）和载量（30mg/mL）下运行，洗脱步骤使用A: 50 mM Tris-HAc, 1 M (NH₄)₂SO₄, pH7.0和B: 50 mM Tris-HAc, pH7.0, 进行0~100% B线性梯度洗脱。

通过Fig.3可以发现半抗以及高分子量杂质在洗脱峰尾富集，并且与目标双抗明显的分离。在这种情况下，主要是利用目标双抗和高分子量聚集体之间疏水性差异实现分离。同时根据图谱来看，Diamond MMC Mustang与某进口复合模式填料（MMC）在分离效果和产品质量上基本保持一致。

Fig.3 使用Diamond MMC Mustang和某进口复合模式层析柱在线性盐梯度洗脱条件下的叠加层析图谱
 

BsAb的复杂结构带来了多种纯化挑战，但通过合理的设计和纯化策略，可以有效提高目标BsAb的纯度和产量。这些策略包括亲和层析、离子交换层析、复合模式层析和疏水层析等，每种方法都有其特定的应用场景和优势。

通过使用不同层析原理的填料进行有效组合，使得杂质在精纯层析步骤中尽可能多的去除，最终得到稳健的下游工艺，使双特异性抗体产品质量满足放行要求。

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