利用P4SPR分子互作仪进行抗体结合分析之比较静态和动态SPR特性
2025-01-09 来源:本站 点击次数:816引言
表面等离子体共振仪器可以提供例如动力学、亲和力和浓度等丰富的信息。P4SPR分子互作仪具有两种不同类型的设置，可以进行静态和动力学 SPR 分析。在静态系统中，样品溶液通过注射器手动引入流动池并通过扩散与表面发生相互作用。在动力学系统中，（通过手动注射器或自动进样器）将样品溶液先装入样品环，然后通过注射泵将运行缓冲液流过样品环，将样品引入流动池中。
本文描述了固定化多克隆鼠抗人 IgG (MAH IgG) 与全人 IgG (Hm IgG) 在静态和动态 Affinite Instruments SPR 设备之间的生物分子相互作用。
让我们首先定义基本的亲和力和动力学参数。使用基本的 Langmuir 结合模型假设固定配体 (L) 与分析物 (A) 相互作用的比例为 1:1。
A+L⇌AL (1)
速率常数 (kon 和 koff) 分别表示正向 (结合) 和反向 (解离) 反应。解离平衡常数 KD 表示一半表面固定配体与分析物结合的时间，可以用游离分析物 [A]、配体 [L] 和分析物-配体复合物 [AL] 的浓度来表示 (等式 2)。或者，KD 可以使用速率常数 kon 和 koff（或者 ka 和 kd）来定义 (等式 2)：
KD 通常是作为求解参数的首选，因为它以摩尔浓度 (M) 表示，而缔合平衡常数 KA 以 M-1 表示。
P4SPR分子互作仪静态与动态SPR分析
动力学分析和静态分析均以不同的方式提供有价值的信息。
动力学分析使我们能够了解分子相互作用的动态，因为它可以洞悉结合的速度和强度。它有助于研究生物过程的机制并开发靶向疗法。通过实时监测相互作用，我们可以评估结合率和解离率并得出亲和常数。
另一方面，静态分析非常适合分析物的筛选和定量。它提供了特定时间点的结合快照，允许快速分析大量样本集。由于简化的样品引入过程、更快的基线建立和高效的系统冲洗，静态 SPR 中的检测时间最多可以是动态 SPR 的一半。这使得静态 SPR 成为特异性筛选、分析物定量和基本亲和力表征的省时选择。
通过利用动力学和静态分析，我们可以全面了解分子相互作用。动力学分析有助于我们揭示结合的动态方面，而静态分析则可以进行有效的筛选和量化。它们共同提供了结合过程的整体视图，从初始关联到稳态结合水平。
表 1 静态和动态SPR 实验模式之间的特征比较
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SPR应用 |
静态分析 |
动力学分析 |
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实时结合数据 |
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特异性筛选/排序 |
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浓度分析 |
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亲和力表征(KD) |
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动力学表征(kon/koff) |
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同时分析四个样品 |
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单周期和多周期分析 |
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仪器
图 1 和图 2 显示了用于动力学和静态分析的 Affinité 仪器设备（P4SPR 2.0/P4PRO）。这些仪器的设计简单易用，可用于进行各种分析。通过直观的控制和用户友好的界面，研究人员可以高效地对分析物进行筛选、量化和基本亲和力表征。这些仪器简化了流程，使研究人员能够快速准确地获得有价值的数据。
在这两种 Affinité 仪器设备（P4SPR 2.0/P4PRO）中，样品溶液都是通过手动注射器注射引入设备的。在静态 P4SPR 2.0 系统中，样品直接从注射器入口引入流动池（图 1）。在 P4PRO 动力学系统中，样品溶液手动注入样品环，并可使用 Affipump 流过流动池（图 2）。
图 1 P4SPR 2.0图
图 2 P4PRO图
试验设计在静态和动态系统中，在相同条件下进行了两个类似的测定。首先通过注入 30mM EDC 和 100mM NHS 的 1:1 (v/v) 混合物 4 分钟来激活 Affinité 仪器 MHDA 传感器。捕获试剂鼠抗人 IgG 在 10mM 醋酸钠中以 5ug/mL 制备，调节至 pH 4.5，并在样品通道中手动注入 30 秒。然后通过 6 分钟注入 1M 乙醇胺 pH 8.0 来使两个活化的表面失活。
类似水平的 MAH IgG 被固定在 2 个 MHDA 表面（114RU，61RU）上。相同浓度的样品溶液用 P4SPR 2.0 进行静态分析，用 P4PRO 进行动力学分析。
在含有 PBS 1x + 0.1% Tween-20、pH 7.4 的缓冲液中制备不同浓度的人类 IgG（0.889-72nM，三倍连续稀释），并在 P4SPR 2.0 中以大约 100uL/s 的流速注入 600 秒，在 P4PRO 中以 50uL/min（0.833uL/s）的流速注入 150 秒。在样品注入之间，传感器表面通过 10 秒注入 10mM 甘氨酸盐酸盐（调节至 pH 2.0）进行再生。静态和动态测定中使用的对照是在相同条件下活化和失活的表面，其中流动相同的分析物溶液。
图 3 分子结合事件的方案
结果
在静态 SPR 中，只能观察到结合阶段。图 4 中显示了典型的图形叠加。随着分析物与固定在表面上的配体结合，信号逐渐增加。一旦大多数可用的配体位点被占据，信号就会达到称为稳定状态的平台，此时配体和分析物结合和解离之间达到平衡。曲线的形状和动力学还可以提供有关结合亲和力、结合速率和分析物-配体相互作用的化学计量的定性信息。图 5 中绘制了 SPR 偏移值与浓度的关系，并通过 Affinité 的 ezControl 软件获得了曲线拟合。
图 4 编制不同浓度 (0、0.89、2.7、8.0、24、72nM) 的 Hm IgG 与参考通道调整后的固定化 MAH IgG 结合的静态 SPR 传感图
图 5 通过绘制 RU 中的 SPR 偏移与纳摩尔浓度的关系图，可以对 ezControl 软件中的 KD 进行静态评估
通过此曲线拟合，在 63RU 处评估 Rmax，在 ½ Rmax (KD) 处评估浓度为 4.9nM。
在动力学 SPR 中，结合和解离阶段都是可观察到的。图 6 显示了 Hm IgG 动力学注射的图形叠加。在结合阶段，分析物被注入并允许其与固定在表面上的配体结合。随着结合的发生，SPR 传感图上的信号逐渐增加。信号增加的速率反映了结合速率常数 (ka)，这表明结合发生的速度。结合阶段使我们能够实时监测分析物-配体复合物的形成。
结合阶段之后，解离阶段开始。在此阶段，分析物被运行缓冲液取代，传感图上的信号开始减弱。信号减弱的速率反映了解离速率常数 (kd)，这表明分析物-配体复合物解离的速度。解离阶段使我们能够观察结合的稳定性并测量解离速率。
SPR 中的曲线形状取决于结合动力学和分析物与配体之间的亲和力。在典型的结合场景中，在结合阶段，传感图上的信号迅速增加，直到达到稳定状态，这表明大多数可用的配体位点已被占用。信号达到稳定状态的速率取决于结合速率常数 (ka) 和分析物的浓度。
图 6 编制不同浓度 (0、0.89、2.7、8.0、24、72nM) 的 Hm IgG 与用参考通道和空白调整的固定化 MAH IgG 结合的动力学 SPR 传感图
图 7 显示了动力学数据的描迹拟合：它表示两个连接段，分别代表结合速率和解离速率。结合速率斜率相对较陡表明结合速度较快，而解离速率斜率较平缓表明解离速率较慢，表明抗体结合强。相反，斜率越陡，解离速率越快，抗体结合越弱。
图 7 通过 TraceDrawer 评估动力学参数
表 2 提供了静态 SPR 和动态 SPR 之间各种参数的比较。在动态 SPR 中，分析物-配体相互作用的结合速率 (kon) 为 3.42 x 10^5 M-1*s-1，解离速率 (koff) 为 3.10 x 10^-4 s-1，亲和力 (KD) 值为 1 nM，最大结合响应 (Rmax) 为 83。在静态 SPR 中，kon 和 koff 速率不可观察，Rmax 在 63RU 处评估，KD 评估为 5nM。静态系统中分析物的停留时间越长，Rmax 投影就越高，因此与动态分析相比，KD 值越低，相关性越高。
表 2 通过 TraceDrawer 评估动力学参数（NA：不适用）
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参数 |
静态SPR |
动态SPR |
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KD(nM) |
5 |
1 |
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kon(M-1*s-1) |
NA |
3.42×105 |
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Koff(s-1) |
NA |
3.10×10-4 |
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Rmax(RU) |
63 |
83 |
概括
从动态 SPR 获得的这些参数为生物分子相互作用提供了宝贵的见解。另一方面，静态 SPR 提供了一种更简单、更具成本效益的方法来筛选和量化分析物。
虽然静态 SPR 与动态 SPR 相比提供的参数较少，但它仍然可以在更短的时间内产生类似的结果。静态 SPR 中简化的样品引入过程、更快的基线建立和高效的系统冲洗有助于提高其时间效率。此外，静态 SPR 仪器的简化系统设计和较低成本使它们对许多研究人员来说更容易获得和负担得起.
总之，动态 SPR 提供了一套全面的参数来表征生物分子相互作用，包括亲和力、结合速率、解离速率和最大结合响应。另一方面，静态 SPR 可以提供其中一些参数，例如亲和力，并在更快、更简单、更实惠的系统中提供类似的结果。动态和静态 SPR 之间的选择取决于特定的实验要求和从分析中寻求的信息。
关于 Affinity 仪器
加拿大Affinité Instruments是一家专注于分子互作研究的公司，基于无标记、高灵敏、表面等离子共振技术（SRP技术）开发了性价比极高的个人型分子互作仪，旨在让每位科研工作者和实验室都能够顺利的把分子互作相关实验开展起来，助力生物科学发展。
P4PRO是Affinité Instruments最畅销的一款分子互作仪，其特点是：
①基于SPR原理，实时、无标记、检测相互作用；
②搭配先进的微流控技术，实现高性能和高准确性；
③10分钟内完成1个样本测试；
④一组实验可获得结合特异性、亲和力、动力学等数据；
⑤四通道检测，结合参照通道信号，可进行背景扣除，获得可信数据；
⑥仪器稳定，操作简单，维护简便；
⑦采用注射泵组件，控制精准，信号稳定；
⑧仪器性价比高，单个实验室即可负担；
⑨AfficoatTM芯片可减少SPR试验中的非特异性结合；
⑩芯片耗材成本低，大大降低仪器运行成本。