淀粉总量检测试剂盒使用说明书
2025-02-18 来源:本站 点击次数:140引言
淀粉大致包含两种成分，直链淀粉主要是通过α-1,4-糖苷键连接的 D-葡聚糖，含有极少的 α-1,6 支链；而支链淀粉中葡萄糖分子之间除了以 α-1,4-糖苷键相连外，还有以 α-1,6-糖苷键相连的分支结构。淀粉的酶解法主要是将淀粉置于高温下，通过耐热α-淀粉酶进行糊化，以产生一系列直链和支链糊精，随后用淀粉葡糖苷酶（AMG）定量水解为葡萄糖。在 ATP 和 NADP+ 存在下，使用葡萄糖氧化酶/过氧化物酶 (GOPOD) 试剂或己糖激酶/磷酸葡萄糖脱氢酶检测释放的葡萄糖。在一系列成功研究的基础上，该方法被采用为 AOAC 方法 996.11、AACC国际方法 76-13.01 和 ICC 方法 168。
本试剂盒在 AOAC 方法 996.11 的基础上进行了适当的优化，从而提供了一个更加方便用户的淀粉检测方法，即快速总淀粉检测法(RTS)(图 1)[程序(a)]。
图 1 快速总淀粉检测法(RTS) [程序(a)]
本试剂盒可用来检测各种食品、饲料、植物和谷物产品（天然或加工）中的总淀粉含量。对于大多数样品（例如小麦粉），在耐热 α-淀粉酶存在的情况下，淀粉能在约 100 ℃的孵育过程中完全溶解。含有高水平抗性淀粉（例如高直链玉米淀粉）的样品则需要在 1.7 M 的冷 NaOH 或热的 DMSO 中预溶解。对于仅含有可溶性淀粉或麦芽糊精的样品，不需要用耐热α-淀粉酶进行孵育。
反应原理
耐热 α-淀粉酶将淀粉水解成可溶性的带支链/不带支链的麦芽糖糊精 (1)。
必要时，可通过用冷的 1.7 M NaOH 搅拌来预溶解样品中的抗性淀粉，然后用乙酸钠缓冲液中和，用 α-淀粉酶水解(2)。
另外，在 100°C 的 DMSO 中进行溶解也是有效的方法。
淀粉葡萄糖苷酶 (AMG) 可将麦芽糊精定量水解为 D-葡萄糖 (3)。
D -葡萄糖氧化为 D -葡萄糖酸，释放等摩尔量的过氧化氢(H2O2)，该反应在含过氧化物酶和醌亚胺染料的比色反应中可定量检测（4, 5）。
单个样品的分析可以在 70 分钟内完成，20 个样品可以在 2 小时内完成。
特异性、灵敏度、线性和精密度
特异性、灵敏度、线性和精密度
该试剂盒对 α-葡聚糖（包括淀粉、糖原、植物糖原和非抗性麦芽糊精）具有特异性。
该试剂盒的最小吸光度差异为 0.010 单位。 根据推荐的总淀粉 (RTS) 方法，使用 100 mg 的样品重量和 10.2 mL 的提取体积，这相当于约 0.09 g/100 g 的总淀粉含量。检出限为 0.18 g/100 g 总淀粉，即样品质量为 100 mg，提取体积为10.2 mL 时，吸光度差异为 0.020。该方法在每次检测 4-100 μg D -葡萄糖范围内时呈线性关系。
干扰
如果 D-葡萄糖的转化在测试规定的时间内（约 20 分钟）完成，一般可以认为没有发生干扰。
试剂盒
Megazyme 提供对总淀粉含量进行 50/100 次检测的试剂盒。该试剂盒包含完整的检测方法以及：
瓶 1：耐热 α-淀粉酶（Megazyme 货号：E-BSTAA。pH 6.5，40°C，3,000 U/mL；pH 5.0，40°C，3,000 U/mL），在 4°C 下可稳定储存 4 年以上，在-10°C 下可稳定保存 10 年以上。
K-TSTA-50A: 5 mL
K-TSTA-100A: 10 mL
瓶 2：淀粉葡萄糖苷酶（Megazyme 货号：E-AMGDF。pH 4.5，40°C 时，底物为可溶性淀粉，酶活为3300 U/mL；底物为对硝基苯-β-麦芽糖苷，酶活为200 U/mL），在 4°C 下可稳定储存 4 年以上，在-10°C 下可稳定保存 10 年以上。
K-TSTA-50A: 5 mL
K-TSTA-100A: 10 mL
瓶 3：GOPOD 试剂缓冲液。缓冲液（50 mL，pH 7.4），含对羟基苯甲酸和叠氮化钠（0.09% w/v）。在 4°C 下可稳定储存 4 年以上。
瓶 4：GOPOD 试剂酶。含葡萄糖氧化酶、过氧化物酶和 4-氨基安替比林。冻干粉。在-10°C 下可稳定保存 4 年以上。
瓶 5：D-葡萄糖标准溶液（5 mL，1.0 mg/mL），溶剂为 0.2% (w/v) 苯甲酸。室温保存，可稳定保存 5 年以上。
瓶 6：标准化常规玉米淀粉质控样。小瓶标签上显示的是淀粉含量。室温保存，可稳定保存 5 年以上。
A. 试剂/悬液的制备：
3. 将瓶 3（GOPOD 试剂缓冲液）用去离子水定容至 1L，配制完成后立即使用。
4. 先将瓶 4 中的内容物溶于 20mL 的溶液 3 中，再将其和剩余的溶液 3 混匀。用铝箔纸将试剂瓶包裹以避光放置。此试剂称之为为葡萄糖测定试剂(GOPOD Reagent)。在 2-5°C 下可稳定储存约 3 个月。在-10°C 下可稳定保存 12 个月以上。
5＆6. 瓶 5、瓶 6 中的内容物可直接使用。室温保存，可稳定保存 5 年以上。
B. 试剂配制（本试剂盒不提供）
试剂 4 NaOH 溶液 (1.7M)将 68g NaOH 添加到 900mL 去离子水中并搅拌溶解，定容至 1L。储存在密封容器中。在室温下可稳定储存 2 年以上。
试剂 5 含氯化钙（5mM）和叠氮化钠（0.02%w/v）的 MOPS 缓冲液 (50mM，pH 7.0)
注意:待 pH 值调整完成后再加叠氮化钠。叠氮化钠酸化时会释放出有毒气体。
试剂 6 乙醇（50%和 80% v/v）50%v/v：将 500mL 乙醇(95%v/v)添加到 500mL 蒸馏水中。
D. 控制和预防措施
4. 使 用 HandyStep® 移液器 [C(l)] ， 将 0.1mL 未稀释的耐热 α- 淀粉酶[A(1)](Megazyme 货号：E-BSTAA)立即加到其中一支试管（样品试管）中。在第二支试管（样品空白）中，加入 0.1mL 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液（100mM，pH5.0）[B(a)]。
5.涡旋[C(j)]试管 3 秒，轻轻盖上管子（勿盖紧），将它们立即转移到微沸水浴中并启动计时器。约 2min 后，拧紧盖子并在涡旋混合器上剧烈混合试管内容物 5秒（涡旋后放回微沸水浴中）。后再 5min 和 10min 后，分别再次涡旋混合试管。以加入 α-淀粉酶为起点开始计时，待孵育 15min 后，从微沸水浴中取出试管，再置于涡旋混合器上剧烈混合 5 秒，将试管置于 50°C 水浴锅中，孵育 5 分钟以上直至温度稳定。
6.使用 HandyStep®移液器，向其中一支试管（样品试管）中加入 0.1mL 未稀释的淀粉葡糖苷酶[A(2)]（AMG，Megazyme 货号：E-AMGDF，3,300U/mL)，涡旋 3秒。在第二支试管（样品空白）中，加入 0.1mL 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液（100mM，pH5.0）[B(a)]。将各试管于 50°C 水浴中孵育 30min，勿再继续混合。
7.从水浴中取出试管，让它们冷却至室温超过 10min 后。将试管上下翻转几次，以确保试管盖内侧的冷凝水与管中的液体混合。
8.分别取 2.0mL 溶液（样品和样品空白）转移到微量离心管[B(a)]中，以 13,000rpm离心 5min（请保留试管中剩余的 8.2mL 孵育溶液并参考下面的注释）。使用移液枪准确吸取 1.0mL 上清液，转移到 12x120mm 试管中，该试管已预先加入 4mL含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液（100mM，pH5.0）[B(a)]，混合。
9.样品一式两份，准确地吸取 0.1mL 至 16x120mm 玻璃试管的底部。同时，样品空白一式一份，吸取 0.1mL 至 16x120mm 玻璃试管的底部。
同时进行孵育的：
11.计算淀粉含量（参见第 F 部分，第 15 页）。
1.研磨谷物、植物或其它食品样品以通过 0.5 毫米的筛网。
1.通过使用涡旋混合器搅拌或上下翻转来彻底混合样品内容物。如有必要，加热或均质样品以获得均匀的悬浮液。
1.通过在涡旋混合器上搅拌或上下翻转来彻底混合样品内容物。如有必要，加热或均质样品以获得均匀的悬浮液。
1. 使用提供的瓶 1 中的内容物。该溶液是粘性的，因此应该用容积式分配器进行操作，例如 搭配 5.0 mL 吸头 BRAND PD-Tip®使用的 BRAND HandyStep® S（用于移取 0.1 mL 的试样）。
在 4°C 下可稳定储存 4 年以上。
在-10°C 下可稳定保存 10 年以上。
注：如果使用者参考 AOAC 官方方法 996.11（方法 c），请用含 5 mM 氯化钙的MOPS 缓冲液（50 mM，pH 7.0）[B(e)]将瓶 1 的内容物稀释 30 倍后再使用。
2. 使用提供的瓶 2 中的内容物。该溶液是粘性的，因此应该用容积式分配器进行操作，例如 搭配 5.0 mL 吸头 BRAND PD-Tip®使用的 BRAND HandyStep® S（用于移取 0.1 mL 的试样）。
在 4°C 下可稳定储存 4 年以上。
在-10°C 下可稳定保存 10 年以上。
3. 将瓶 3（GOPOD 试剂缓冲液）用去离子水定容至 1L，配制完成后立即使用。
注：
（1）储存时，浓缩缓冲液中可能会形成盐晶体。当该缓冲液用去离子水稀释至 1L
（1）储存时，浓缩缓冲液中可能会形成盐晶体。当该缓冲液用去离子水稀释至 1L
时，它们必须完全溶解。
（2）该缓冲液含有 0.09% (w/v) 叠氮化钠。这是一种有毒化学品，配制时请做好安全防
护。
4. 先将瓶 4 中的内容物溶于 20mL 的溶液 3 中，再将其和剩余的溶液 3 混匀。用铝箔纸将试剂瓶包裹以避光放置。此试剂称之为为葡萄糖测定试剂(GOPOD Reagent)。在 2-5°C 下可稳定储存约 3 个月。在-10°C 下可稳定保存 12 个月以上。
注：
（1）如果该试剂以冷冻状态储存，最好将其分装为约 200 mL 的等分试样，在使用
（1）如果该试剂以冷冻状态储存，最好将其分装为约 200 mL 的等分试样，在使用
过程中仅冷冻/解冻一次。
（2）新配制的试剂可能呈淡黄色或淡粉色。在 4°C 储存的 2-3 个月内，溶液颜色会逐渐转变为深粉红色。以去离子水为背景时，该溶液的吸光度应小于 0.05。
5＆6. 瓶 5、瓶 6 中的内容物可直接使用。室温保存，可稳定保存 5 年以上。
B. 试剂配制（本试剂盒不提供）
试剂 1 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液 (100mM，pH 5.0)将 5.8mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 900mL 蒸馏水中。通过添加 1M (4g/100mL)氢氧化钠溶液（需要大约 30mL）将 pH 值调节至 5.0。加入 0.74g 二水氯化钙并溶解。定容至 1L，将该缓冲液储存于 4°C，在 4°C 下可稳定储存 6 个月以上。
试剂 2 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液 (200mM，pH 4.5)将 11.6mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 900mL 蒸馏水中。通过添加 1M (4g/100mL)氢氧化钠溶液（需要大约 60mL）将 pH 值调节至 4.5。加入 0.74g 二水氯化钙并溶解。定容至 1L，将该缓冲液储存于 4°C，在 4°C 下可稳定储存 6 个月以上。
试剂 3 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液 (600mM，pH 3.8)将 69.6mL 的冰醋酸(1.05g/mL)添加到 1600mL 蒸馏水中。通过添加 4M（16g/100mL)氢氧化钠溶液将 pH 值调节至 3.8。加入 1.48g 二水氯化钙并溶解。定容至 2L。该缓冲液可在室温下稳定储存 12 个月以上。
试剂 4 NaOH 溶液 (1.7M)将 68g NaOH 添加到 900mL 去离子水中并搅拌溶解，定容至 1L。储存在密封容器中。在室温下可稳定储存 2 年以上。
试剂 5 含氯化钙（5mM）和叠氮化钠（0.02%w/v）的 MOPS 缓冲液 (50mM，pH 7.0)
可选：仅当使用程序 (c) 和 (d) 分析样品时才需要。将 11.55g MOPS（钠盐，Sigma 目录号 M9381）溶解在 900mL 蒸馏水中，通过添加 1M (10%v/v) HCl（需要约 17mL）将 pH 值调节至 7.0。加入 0.74 克二水氯化钙和 0.2 克叠氮化钠并溶解。定容至 1L。将该缓冲液储存于 4°C，在 4°C 下可稳定储存 6 个月以上。
注意:待 pH 值调整完成后再加叠氮化钠。叠氮化钠酸化时会释放出有毒气体。
试剂 6 乙醇（50%和 80% v/v）50%v/v：将 500mL 乙醇(95%v/v)添加到 500mL 蒸馏水中。
80%v/v：将 800mL 乙醇(95%v/v)添加到 200mL 蒸馏水中。将各试剂储存在 1L 试剂瓶中。在室温下可稳定储存 4 年以上。
C. 需要的设备
1. 研磨机
2. 离心机（4000rpm）3. 微量离心管（13000rpm）
4. 分光光度计，能够在 510 nm（10 mm 路径长度）下运行
5. 分析天平
6. 恒温水浴锅（50℃）
7. 沸水浴锅（配有试管架）
8. 磁力搅拌器
9. 涡旋搅拌器
10. 移液器/移液枪
11. 容积式移液器（如 Brand HandyStep® S）
12. 一次性离心管（13mL, 101×16.5mm）
13. 一次性微量离心管（2.0mL）
14. 玻璃试管（14mL, 16×100mm）
15. 康宁培养管（16 x 120 mm, 带螺帽）
16. 塑料“午餐盒”（足够容纳试管架，作冰水浴用）
D. 控制和预防措施
a. 与 GOPOD 试剂进行孵育的时间并不重要，但应至少为 20 分钟，并在显色反应 60 分钟内进行吸光度检测。
b. 每组检测都应包括空白试剂和葡萄糖标准品对照（100 μg，一式四份）。葡萄糖-GOPOD 的标准曲线应具有线性。
i)空白试剂：0.1 mL 蒸馏水+ 3.0 mL GOPOD 试剂。
ii)葡萄糖标准品：0.1 mL 葡萄糖标准溶液 (100 μg/0.1 mL) +3.0 mL GOPOD 试剂。系数因子“F”（第 15 和 16 页）的计算方法是将分析的 D-葡萄糖质量（100 μg）除以其在检测中得到的吸光度结果（例如 100/1.038 = 96.386）。每次检测所得到的吸光度值可能会有所不同。
c. 对于每一次检测，都应包括标准面粉或淀粉样品。
d. 对于每新批次的 GOPOD 试剂，每 100 μg 葡萄糖标准品反应达到终点时所需时间大约为 15 分钟（通过显色效果来判断反应是否到达终点）。
E. 操作流程(a)测定不含抗性淀粉的谷物和食品中的淀粉含量（推荐操作流程；在 pH5.0 下孵育），即总淀粉含量快速检测(RTS)方法
1.碾磨谷物、植物或其它食品样品以通过 0.5 毫米的筛网。
2.准确称取 100mg 测试样品，一式两份（一份作为样品空白）放入带盖康宁培养(16x120mm)[C(q)]，记录准确的重量。轻敲试管，使样品落到试管底部。
3.使用 Brand®瓶口分液器[C(m)]，分别向两支试管中加入 10mL 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液(100mM，pH5)[B(a)]，在涡旋混合器上剧烈搅拌试管 5 秒。
4. 使 用 HandyStep® 移液器 [C(l)] ， 将 0.1mL 未稀释的耐热 α- 淀粉酶[A(1)](Megazyme 货号：E-BSTAA)立即加到其中一支试管（样品试管）中。在第二支试管（样品空白）中，加入 0.1mL 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液（100mM，pH5.0）[B(a)]。
5.涡旋[C(j)]试管 3 秒，轻轻盖上管子（勿盖紧），将它们立即转移到微沸水浴中并启动计时器。约 2min 后，拧紧盖子并在涡旋混合器上剧烈混合试管内容物 5秒（涡旋后放回微沸水浴中）。后再 5min 和 10min 后，分别再次涡旋混合试管。以加入 α-淀粉酶为起点开始计时，待孵育 15min 后，从微沸水浴中取出试管，再置于涡旋混合器上剧烈混合 5 秒，将试管置于 50°C 水浴锅中，孵育 5 分钟以上直至温度稳定。
6.使用 HandyStep®移液器，向其中一支试管（样品试管）中加入 0.1mL 未稀释的淀粉葡糖苷酶[A(2)]（AMG，Megazyme 货号：E-AMGDF，3,300U/mL)，涡旋 3秒。在第二支试管（样品空白）中，加入 0.1mL 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液（100mM，pH5.0）[B(a)]。将各试管于 50°C 水浴中孵育 30min，勿再继续混合。
7.从水浴中取出试管，让它们冷却至室温超过 10min 后。将试管上下翻转几次，以确保试管盖内侧的冷凝水与管中的液体混合。
8.分别取 2.0mL 溶液（样品和样品空白）转移到微量离心管[B(a)]中，以 13,000rpm离心 5min（请保留试管中剩余的 8.2mL 孵育溶液并参考下面的注释）。使用移液枪准确吸取 1.0mL 上清液，转移到 12x120mm 试管中，该试管已预先加入 4mL含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液（100mM，pH5.0）[B(a)]，混合。
9.样品一式两份，准确地吸取 0.1mL 至 16x120mm 玻璃试管的底部。同时，样品空白一式一份，吸取 0.1mL 至 16x120mm 玻璃试管的底部。
10.在各试管中加入 3.0mLGOPOD 试剂，混匀后。在 50°C 水浴中孵育 20min，冷却后在 1h 内于 510nm 处测量溶液吸光度（以样品空白溶液为参照，仅当进行了样品空白的测定时）。
同时进行孵育的：
葡萄糖标准对照：0.1mL 葡萄糖标准溶液(1.0mg/mL)加 3.0mLGOPOD 试剂，一式四份。
试剂空白对照：0.1mL 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液（100mM，pH5.0）[B(a)]加 3.0mLGOPOD 试剂，一式两份。（测定葡萄糖标准溶液时参照）
11.计算淀粉含量（参见第 F 部分，第 15 页）。
注意:对于这个提取流程，最终的提取体积(EV)=10.2
注 1：如果样品的 GOPOD 吸光度值小于 0.100，则无需进一步稀释即可直接分析样品上清液（步骤 8）。如果吸光度值大于 1.20，则将 1.0mL 样品上清液与10.0mL 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液（100mM，pH5.0）[B(a)]充分混合，然后吸取 0.1mL 混合后的液体用于 GOPOD 分析。对于淀粉含量低于 1%(w/w)的样品，将样品量增加到 500mg，并直接分析 0.1mL 未稀释的样品溶液。
稀释倍数(D)=1、5 或 11
注 2：当检测牧草、青贮饲料等高纤维样品时，使用搅拌机研磨样品（参见 KTSTA 视频）。研磨时间约 60 秒（直到样品均匀）。分析 500mg 样品时，根据“a”流程进行操作，但在微沸水浴中与耐热 α-淀粉酶的孵育时间需延长至 60min。在淀粉葡糖苷酶孵育及冷却至室温等步骤后，对于淀粉含量大约在 20-30%的青贮样品，用蒸馏水将1mL的样品液稀释20倍，充分混匀后吸取约2mL，以13,000rpm离心 5 分钟，然后一式两份，以 0.1mL 上清液与 GOPOD 试剂反应。稀释倍数(D)=20
b)测定含有抗性淀粉样品的总淀粉含量（RTS-NaOH 流程-推荐）
1.准确称取 100mg 测试样品，一式两份，放入带盖康宁培养管(16x120mm)[C(q)]，记录准确的重量。轻敲试管，使样品落到试管底部。
2.加入 0.2mL80%v/v 的乙醇水溶液，在涡旋混合器上混匀样品（此步骤很重要，有助于高淀粉含量样品的完全溶解）。
3.使用 HandyStep®移液器加入 2mL 的冷 1.7M 氢氧化钠溶液[B(d)]，并在涡旋混合器上搅拌 15s。之后将试管放置于冰水浴中的试管架上，使用磁力搅拌器搅拌冰水浴 15min（第 18 页，图 2）。在此期间，还需要在涡旋混合器上间歇性地搅拌管中内容物 2-3 次。确保样品悬浮液没有结块。
3.使用 HandyStep®移液器加入 2mL 的冷 1.7M 氢氧化钠溶液[B(d)]，并在涡旋混合器上搅拌 15s。之后将试管放置于冰水浴中的试管架上，使用磁力搅拌器搅拌冰水浴 15min（第 18 页，图 2）。在此期间，还需要在涡旋混合器上间歇性地搅拌管中内容物 2-3 次。确保样品悬浮液没有结块。
4.使用 Brand®瓶口分液器[C(m)]，加入 8mL 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液(600mM，pH3.8)[B(c)]。在涡旋混合器上搅拌试管。调节 pH 在 5.0 左右。
5.使用 HandyStep®移液器，将 0.1mL 未稀释的耐热 α-淀粉酶[A(1)]立即添加到其中一支试管（样品管）中，然后将 0.1mL 淀粉葡糖苷酶（AMG，3,300U/mL)[A(2)]添加到同一管中。在第二支试管（样品空白）中，加入 0.2mL 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液（100mM，pH5.0）[B(a)]。将两个试管的盖子盖紧并涡旋 3 秒以上。
6.将试管在 50°C 水浴中孵育 30min。
7.从水浴中取出试管，冷却至室温。将试管上下倒转几次，以确保盖子内侧的冷凝水与管中的液体充分混合。
8.按照第 9 页上(a)方法中的步骤 8 继续进行操作。提取体积(EV)=10.4
稀释倍数(D)=1、5 或 11
(c)测定不含抗性淀粉、D-葡萄糖及麦芽糊精的谷物和食品中的淀粉（AOAC 官
方方法 996.11）
1.研磨谷物、植物或其它食品样品以通过 0.5 毫米的筛网。
2.将研磨样品（约 100mg；准确称重）加入带盖康宁培养管（16x120mm）[C(q)]。轻敲试管以确保所有样品都落到试管底部。
3.加入 0.2mL80%v/v 的乙醇水溶液，在涡旋混合器上混匀以分散样品。
4.立即加入 3mL 稀释后的耐热 α-淀粉酶[A(1)]（α-淀粉酶用含 5mM 氯化钙的MOPS 缓冲液（50mM，pH7.0）[B(e)]稀释 30 倍），拧紧盖子，将试管置于微沸水浴中孵育 6min，其中在第 2、4 和 6min 剧烈涡旋（以确保完全均匀）。
5.将试管置于 50°C 的水浴中，加入 4mL 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液(200mM，pH4.5)[B(b)]，然后加入 0.1mL 淀粉葡糖苷酶（AMG，3,300U/mL)[A(2)]。使用涡旋混合器搅拌试管，在 50°C 水浴锅中孵育 30min。6.将试管中的全部内容物转移到 100mL 容量瓶中（可使用漏斗辅助），并用洗瓶彻底冲洗试管中残留的内容物。使用含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液(200mM，pH4.5)[B(b)]进行定容并摇匀。
7.将每个样品溶液取 2.0mL，转移到微量离心管[C(o)]中，以 13,000rpm 的速度离心 5 分钟。
8.每个样品一式二份，准确吸取 0.1mL 至 16x120mm 玻璃试管的底部。
9.加入 3.0mLGOPOD 试剂并在 50°C 水浴中孵育 20min，于 510nm 处测量溶液吸光度（以试剂空白为参照）。
10.计算淀粉含量（参见第 F 部分，第 15 页）。提取体积(EV)=100（参见第 15 页的计算步骤）
稀释倍数(D)=1(d)测定含有抗性淀粉但不含 D-葡萄糖和/或麦芽糊精的样品的总淀粉含量
（DMSO 方法——AOAC 官方方法 996.11）
1.研磨谷物、植物或其它食品样品以通过 0.5 毫米的筛网。
2.将研磨样品（约 100mg；准确称重）加入带盖康宁培养管（16x120mm）[C(q)]。
3.加入 0.2mL80%v/v 的乙醇水溶液，在涡旋混合器上混匀以分散样品。
4.立即向试管中加入 2mL 二甲基亚砜(DMSO)并在涡旋混合器上混匀。将试管置于剧烈沸腾的水浴中孵育，5 分钟后取出。
5.立即将3mL耐热α-淀粉酶[A(1)]（使用含5mM氯化钙的MOPS缓冲液（50mM，pH7.0）稀释 30 倍）[B(e)]加入至每个试管中，并在涡旋混合器上剧烈混合 20 秒。将试管放回至沸水浴中，孵育 6 分钟，其中在第 2、4 和 6 分钟时剧烈涡旋（以确保完全均匀）。
6.按照第 12 页中的方法(c)步骤 5 继续进行实验。
提取量（EV）=100；稀释倍数(D)=1
(e)测定含 D-葡萄糖和/或麦芽糊精的样品总淀粉含量的建议性程序（含/不含抗性淀粉）——用酒精洗涤去除 D-葡萄糖和麦芽糊精
[注意：麦芽糊精在乙醇水溶液中的溶解度主要取决于麦芽糊精的 DP 范围、乙醇最终浓度和溶液温度]。
1.研磨谷物、植物或其它食品样品以通过 0.5 毫米的筛网。
2.将研磨样品（约 100mg，准确称重）加入玻璃离心管（16x100mm；14mL 容量）[C(p)]。
3.加入 5.0mL 乙醇水溶液(80%v/v)并在 80-85°C 下孵育 5 分钟。在涡旋搅拌器上混合内容物，然后再加入 5mL 的 80%乙醇水溶液。
4.在台式离心机[C(b)]上以 3250rcf(约 4,000rpm)离心 10 分钟，丢弃上清液。
5.将沉淀重悬在 5mL 的 80%乙醇水溶液中，并在涡旋混合器上搅拌。再加入 5mL的 80%乙醇水溶液，并上下摇匀混合。按步骤 4 离心并小心倒出上清液。
6.按照第 12 页中的方法(c)步骤 4 继续进行实验。
提取量（EV）=100；稀释倍数(D)=1
或者：
如果样品含有抗性淀粉，请从第 13 页中程序(d)的步骤 4 继续实验。
提取量（EV）=100；稀释倍数(D)=1
(f)测定样品中以可溶或悬浮形式存在的淀粉含量
1.通过使用涡旋混合器搅拌或上下翻转来彻底混合样品内容物。如有必要，加热或均质样品以获得均匀的悬浮液。
2.各个样品一式两份（一份作为样品空白），使用移液器分别吸取 5mL（样品和样品空白），转移到两个康宁培养管（16x120mm）[C(q)]中。使用 Brand®瓶口分液器[C(m)]，向每个培养管中添加 5mL 含 5mM 氯化钙的醋酸钠缓冲液(200mM，pH4.5)[B(b)]。在涡旋混合器上剧烈搅拌培养管 5 秒。
3.对于样品和样品空白，按照第 9 页步骤 4 中的程序(a)继续操作。
4.计算淀粉含量（液体样品计算，请参考第 16 页的 F 部分）
稀释样品体积(DSV)=10.2mL
稀释倍数(D)=1、5 或 11；样品体积(SV)=5mL
(g)测定含有悬浮状态抗性淀粉的样品中的淀粉含量
1.通过在涡旋混合器上搅拌或上下翻转来彻底混合样品内容物。如有必要，加热或均质样品以获得均匀的悬浮液。
2.各个样品一式两份（一份作为样品空白），使用移液器分别吸取 2mL（样品和样品空白），转移到两个康宁培养管（16x120mm）[C(q)]中。使用 HandyStep®移液器加入 2mL 的冷 1.7M 氢氧化钠溶液[B(d)]，并在涡旋混合器上搅拌 15s。之后将试管放置于冰水浴中的试管架上，使用磁力搅拌器搅拌冰水浴 15min（第 18页，图 2）。在此期间，还需要在涡旋混合器上间歇性地搅拌管中内容物 2-3 次。确保样品悬浮液没有结块。
3.对于样品和样品空白，按照第 11 页步骤 4 中的程序(b)继续操作。
稀释样品体积(DSV)=12.2mL
稀释倍数(D)=1、5 或 11；样品体积(SV)=2mL
(h)抗酶解淀粉的测定
使用Megazyme提供的抗性淀粉检测试剂盒(K-RSTAR)或快速抗性淀粉检测试剂盒(KRAPRS)准确测量抗性淀粉。使用 K-RSTAR 或 K-RAPRS 获得的结果与在体内实验中获得的结果非常相似。抗性淀粉检测试剂盒(K-RSTAR)已成功通过多个实验室的评估（37 个实验室，16 个样品），并成为 AOAC 官方方法 2002.02 和AACC 方法 32-40.01。
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