抗端粒酶M1RNA核酶载体构建及肝癌转染
2025-02-24 来源:威尼德生物科技 点击次数:45
摘要
构建抗端粒酶M1RNA核酶载体，并通过转染技术将其导入肝癌细胞，以探讨其对端粒酶活性的抑制作用。实验采用分子克隆技术构建载体，利用威尼德电穿孔仪进行细胞转染，通过某试剂检测端粒酶活性。结果表明，构建的核酶载体能有效抑制肝癌细胞端粒酶活性，为肝癌治疗提供了新的实验依据。
引言
端粒酶在维持端粒长度和细胞永生中起关键作用，其活性在大多数恶性肿瘤中显著升高。M1RNA是端粒酶的核心组分，抑制其表达可有效降低端粒酶活性。核酶是一种具有催化活性的RNA分子，可特异性地切割靶RNA。本研究旨在构建针对M1RNA的核酶载体，并通过转染技术将其导入肝癌细胞，以评估其对端粒酶活性的抑制作用。
实验部分
1. 材料与方法
1.1 材料
· 肝癌细胞系：HepG2
· 质粒载体：pEGFP-N1
· 限制性内切酶：某试剂
· DNA连接酶：某试剂
· 细胞培养基：某试剂
· 转染试剂：某试剂
· 端粒酶活性检测试剂盒：某试剂
1.2 方法
1.2.1 核酶序列设计与合成
根据M1RNA的序列，设计并合成特异性核酶序列。核酶序列包括催化核心和两侧的靶向序列，确保其能特异性地识别和切割M1RNA。
1.2.2 载体构建
1. 将合成的核酶序列克隆入pEGFP-N1质粒载体中。
2. 使用某试剂进行限制性内切酶消化，验证插入序列的正确性。
3. 通过DNA连接酶将核酶序列与载体连接，构建重组质粒。
4. 转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，并进行测序验证。
1.2.3 细胞培养
1. HepG2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中。
2. 细胞传代时，用0.25%胰酶消化，按1:3比例分瓶培养。
1.2.4 细胞转染
1. 将HepG2细胞接种于6孔板，密度为1×105 cells/well。
2. 待细胞密度达到80%时，用威尼德电穿孔仪进行转染。
3. 转染条件：电压200 V，电容950 μF，脉冲时间20 ms。
4. 转染后，细胞继续培养48小时，观察绿色荧光蛋白表达情况。
1.2.5 端粒酶活性检测
1. 收集转染后的细胞，用某试剂提取总蛋白。
2. 使用端粒酶活性检测试剂盒，按照说明书进行操作。
3. 通过威尼德紫外交联仪进行信号检测，分析端粒酶活性。
1.2.6 数据分析
1. 所有实验重复三次，数据以均值±标准差表示。
2. 使用SPSS软件进行统计分析，采用t检验比较组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 核酶载体构建
成功构建了含有抗M1RNA核酶序列的重组质粒，测序结果证实核酶序列正确插入载体中。
2.2 细胞转染
转染48小时后，荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，表明核酶载体成功导入HepG2细胞。
2.3 端粒酶活性
转染核酶载体的HepG2细胞端粒酶活性显著降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。
3. 讨论
本研究成功构建了抗端粒酶M1RNA核酶载体，并通过威尼德电穿孔仪将其高效转染入肝癌细胞。实验结果表明，核酶载体能有效抑制肝癌细胞端粒酶活性，为肝癌的基因治疗提供了新的思路。
4. 结论
本研究构建的抗端粒酶M1RNA核酶载体能有效抑制肝癌细胞端粒酶活性，为肝癌治疗提供了实验依据。未来研究将进一步探讨其在动物模型中的治疗效果及安全性。
参考文献
1. Construction of Porcine Growth Hormone Eukaryotic Expression Vector and Its Transfection Mediated by Cationic Liposome in Mice [J] . Chenchen Penga Lihong Wanga Zizhu Chena Lei Maa Yan Weia Zhangfu Longa* Animal Biotechnology . 2011,第4期
2. Construction of porcine growth hormone eukaryotic expression vector and its transfection mediated by cationic liposome in mice. [J] . Peng ChenChen, Wang LiHong, Chen ZiZhu, Animal Biotechnology . 2011,第1a4期
3. Construction and transfection of sense/antisense eukaryotic expression vectors for human cathepsin L gene [J] . Maolin He, Anmin Chen Journal of Nanjing Medical University . 2005,第3期
4. Construction of MiRNA Eukaryotic Expression Vector and its Stable Expression in Human Liver Cancer Cells [C] . GaoFeng Liang, Shanshan Chen, YanLiang Zhu International Conference on Environment Science and Biotechnology . 2013
5. Functional Investigation of Ribozymes and Ribozyme Candidates in Viruses, Bacteria and Eukaryotes [D] . Chen, Andy G. 2014
6. pVAX-iNOS真核表达载体的构建及其抗肺癌作用研究 [O] . 叶 苏娟 (Sujuan YE), 杨 蔚菡 (Weihan YANG), 王 宇 (Yu WANG), 2012
7. Use of a Transfected and Amplified Drosophila Heat Shock Promoter Construction for Inducible Production of Toxic Mouse C-Myc Proteins in CHO Cells [R] . Wurm, F. M. , Gwinn, K. A. , Papoulas, O. , 1987
构建抗端粒酶M1RNA核酶载体，并通过转染技术将其导入肝癌细胞，以探讨其对端粒酶活性的抑制作用。实验采用分子克隆技术构建载体，利用威尼德电穿孔仪进行细胞转染，通过某试剂检测端粒酶活性。结果表明，构建的核酶载体能有效抑制肝癌细胞端粒酶活性，为肝癌治疗提供了新的实验依据。
引言
端粒酶在维持端粒长度和细胞永生中起关键作用，其活性在大多数恶性肿瘤中显著升高。M1RNA是端粒酶的核心组分，抑制其表达可有效降低端粒酶活性。核酶是一种具有催化活性的RNA分子，可特异性地切割靶RNA。本研究旨在构建针对M1RNA的核酶载体，并通过转染技术将其导入肝癌细胞，以评估其对端粒酶活性的抑制作用。
实验部分
1. 材料与方法
1.1 材料
· 肝癌细胞系：HepG2
· 质粒载体：pEGFP-N1
· 限制性内切酶：某试剂
· DNA连接酶：某试剂
· 细胞培养基：某试剂
· 转染试剂：某试剂
· 端粒酶活性检测试剂盒：某试剂
1.2 方法
1.2.1 核酶序列设计与合成
根据M1RNA的序列，设计并合成特异性核酶序列。核酶序列包括催化核心和两侧的靶向序列，确保其能特异性地识别和切割M1RNA。
1.2.2 载体构建
1. 将合成的核酶序列克隆入pEGFP-N1质粒载体中。
2. 使用某试剂进行限制性内切酶消化，验证插入序列的正确性。
3. 通过DNA连接酶将核酶序列与载体连接，构建重组质粒。
4. 转化大肠杆菌，筛选阳性克隆，并进行测序验证。
1.2.3 细胞培养
1. HepG2细胞在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中。
2. 细胞传代时，用0.25%胰酶消化，按1:3比例分瓶培养。
1.2.4 细胞转染
1. 将HepG2细胞接种于6孔板，密度为1×105 cells/well。
2. 待细胞密度达到80%时，用威尼德电穿孔仪进行转染。
3. 转染条件：电压200 V，电容950 μF，脉冲时间20 ms。
4. 转染后，细胞继续培养48小时，观察绿色荧光蛋白表达情况。
1.2.5 端粒酶活性检测
1. 收集转染后的细胞，用某试剂提取总蛋白。
2. 使用端粒酶活性检测试剂盒，按照说明书进行操作。
3. 通过威尼德紫外交联仪进行信号检测，分析端粒酶活性。
1.2.6 数据分析
1. 所有实验重复三次，数据以均值±标准差表示。
2. 使用SPSS软件进行统计分析，采用t检验比较组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 核酶载体构建
成功构建了含有抗M1RNA核酶序列的重组质粒，测序结果证实核酶序列正确插入载体中。
2.2 细胞转染
转染48小时后，荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达，表明核酶载体成功导入HepG2细胞。
2.3 端粒酶活性
转染核酶载体的HepG2细胞端粒酶活性显著降低，与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05）。
3. 讨论
本研究成功构建了抗端粒酶M1RNA核酶载体，并通过威尼德电穿孔仪将其高效转染入肝癌细胞。实验结果表明，核酶载体能有效抑制肝癌细胞端粒酶活性，为肝癌的基因治疗提供了新的思路。
4. 结论
本研究构建的抗端粒酶M1RNA核酶载体能有效抑制肝癌细胞端粒酶活性，为肝癌治疗提供了实验依据。未来研究将进一步探讨其在动物模型中的治疗效果及安全性。
参考文献
1. Construction of Porcine Growth Hormone Eukaryotic Expression Vector and Its Transfection Mediated by Cationic Liposome in Mice [J] . Chenchen Penga Lihong Wanga Zizhu Chena Lei Maa Yan Weia Zhangfu Longa* Animal Biotechnology . 2011,第4期
2. Construction of porcine growth hormone eukaryotic expression vector and its transfection mediated by cationic liposome in mice. [J] . Peng ChenChen, Wang LiHong, Chen ZiZhu, Animal Biotechnology . 2011,第1a4期
3. Construction and transfection of sense/antisense eukaryotic expression vectors for human cathepsin L gene [J] . Maolin He, Anmin Chen Journal of Nanjing Medical University . 2005,第3期
4. Construction of MiRNA Eukaryotic Expression Vector and its Stable Expression in Human Liver Cancer Cells [C] . GaoFeng Liang, Shanshan Chen, YanLiang Zhu International Conference on Environment Science and Biotechnology . 2013
5. Functional Investigation of Ribozymes and Ribozyme Candidates in Viruses, Bacteria and Eukaryotes [D] . Chen, Andy G. 2014
6. pVAX-iNOS真核表达载体的构建及其抗肺癌作用研究 [O] . 叶 苏娟 (Sujuan YE), 杨 蔚菡 (Weihan YANG), 王 宇 (Yu WANG), 2012
7. Use of a Transfected and Amplified Drosophila Heat Shock Promoter Construction for Inducible Production of Toxic Mouse C-Myc Proteins in CHO Cells [R] . Wurm, F. M. , Gwinn, K. A. , Papoulas, O. , 1987
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