在生物医学的微观探索之旅中，我们一直渴望能够深入了解生物分子在三维空间中的精妙布局。如今，开发了一种结合拉曼染料和组织透明化的多色三维成像技术（RADIANT），实现了在毫米厚度的脑组织切片中一次性成像11种分子组分，把多色成像的深度提升了10到100倍。

研究背景与技术挑战
生物系统是复杂的三维结构，蛋白质在其中的分布和相互作用对理解生命过程至关重要，比如中枢神经系统存在多种神经元亚型，单个神经元延伸广泛，研究蛋白质在大体积组织中的分布意义重大。荧光显微镜是常用的蛋白质成像技术，但因其荧光光谱过宽，存在“颜色屏障”，一般同时成像目标不超5个。高度多重化蛋白质成像技术虽能增加成像目标数量，却大多只能用于薄样本，像循环免疫荧光技术，在厚组织成像时面临诸多难题，如染色时间长、抗原损失、结构损伤以及图像配准困难等。拉曼成像虽理论上可突破荧光限制，但灵敏度欠佳。尽管提升了拉曼成像灵敏度，却受组织光散射影响，成像深度受限。因此，开发能在深层组织中实现高度多重化成像的技术迫在眉睫。

技术创新与应用
拉曼成像的潜力与挑战
拉曼光谱的振动峰极为狭窄，与荧光光谱相比，分辨率更高。这一特性使得拉曼成像在理论层面具备突破荧光成像“颜色壁垒”的能力，有望实现对多种分子的精准区分与成像。例如，不同分子在拉曼光谱中具有各自独特的振动峰，如同每个人独特的“分子指纹”，通过对这些振动峰的识别，能够准确鉴定不同分子。

当拉曼成像技术应用于生物样本时，诸多挑战接踵而至。生物体内分子浓度复杂多样，拉曼成像的灵敏度相对较低，难以有效检测低浓度的生物分子。同时，生物组织犹如一道屏障，对拉曼信号存在强烈的散射和吸收作用。这不仅严重影响成像质量，还极大地限制了成像深度，使得拉曼成像在深层组织成像方面举步维艰。尽管科研人员通过优化实验条件、开发新探针以及结合其他技术提升了其灵敏度，但深层组织成像难题依旧存在，成为阻碍拉曼成像技术广泛应用的关键因素。

RADIANT技术的原理与优势
为攻克这些难题，RADIANT技术应运而生。该技术巧妙融合拉曼染料和组织透明化技术，成为深层生物组织多色成像的创新解决方案。其核心之一是新型拉曼染料——MARS染料。MARS染料具备在拉曼静默区成像的独特能力，有效避开了传统拉曼染料在指纹区成像时易受组织透明化试剂干扰的问题。同时，它能够通过免疫标记的方式，精准地与目标生物分子特异性结合，为研究人员定位和检测目标分子提供了有力工具。

组织透明化技术在RADIANT技术中也起着举足轻重的作用。传统组织透明化方法主要服务于荧光显微镜，并不完全适用于拉曼成像。研究人员经过系统研究与优化，筛选出适配MARS染料的组织透明化技术，并进一步改进开发出rDISCO技术。rDISCO技术通过降低透明化温度、添加抗氧化剂等手段，显著提高了MARS染料成像的信噪比，使得在深层组织中获取高质量成像成为可能。

与传统成像技术相比，RADIANT技术优势明显。它成功打破“颜色壁垒”，在小鼠小脑薄切片上实现12色成像，极大地丰富了成像信息。其成像深度提升了10-100倍，可对毫米厚度的脑组织切片进行成像，让科研人员能够深入探索组织内部的微观结构。此外，RADIANT技术的免疫标记和成像步骤一次完成，所获图像天然具备三维配准效果，无需复杂的配准校正过程，大大提高了成像效率与准确性，为生命科学研究开辟了全新视角，助力科研人员更深入地探索生物微观世界的奥秘。

成像实验与结果分析
拉曼染料与组织透明化的兼容性研究
在RADIANT技术研发中，拉曼染料与组织透明化试剂的兼容性至关重要。组织透明化试剂的高浓度化学物质在拉曼光谱指纹区会产生干扰信号。研究人员测试传统拉曼染料和MARS染料后发现，传统拉曼染料受干扰严重，无法清晰成像；而MARS染料在拉曼静默区成像，能避免干扰，可稳定标记目标生物分子，为RADIANT技术奠定基础。

MARS染料的扩展与多色成像
为提升成像能力，研究人员拓展MARS染料，经筛选确定8种性能良好的染料。结合4种荧光染料，利用免疫标记法在小鼠小脑薄切片上实现12色成像。成像时，先处理小鼠小脑组织，再用标记不同染料的抗体染色，通过拉曼和荧光成像技术，可同时观察多种生物分子分布，像神经元核标记物NeuN、星形胶质细胞标记物GFAP等，展示了小脑组织结构和细胞间关系，体现MARS染料多色成像优势。

组织透明化方法的筛选与优化
研究人员以MARS染料成像信噪比为标准，对多种组织透明化技术进行筛选。此前基于尿素的技术为保脂质牺牲透明效果，不适用于RADIANT技术。经测试，3DISCO和uDISCO表现突出。深入研究发现，uDISCO因试剂配方能更好保护MARS染料，减少过氧化物对其分解，成像质量更优。基于此，研究人员利用uDISCO实现500微米厚脑组织切片一次性8色三维成像，突破厚样品“颜色壁垒”，便于深入研究脑组织微观结构。

rDISCO的开发与性能提升
考虑到MARS染料对过氧化物敏感，研究人员改进uDISCO技术可进一步提升信噪比。rDISCO技术在uDISCO基础上，其提供的信噪比在整个成像深度范围内约是uDISCO的2倍。对1毫米厚度脑组织切片成像显示，rDISCO技术成像更清晰准确，为RADIANT技术广泛应用提供有力支持。

毫米级组织的一次性多重成像
借助rDISCO技术，研究人员成功实现1毫米厚度脑组织切片一次性11色成像。实验时，先对切片免疫标记，用rDISCO技术透明化处理，再进行拉曼和荧光成像。这种一次性成像避免传统循环免疫荧光技术的配准校正难题，保证图像质量。获得的11色三维图像清晰展示脑组织不同细胞类型和生物分子分布，有助于研究人员探究其分布规律和作用机制，为神经系统疾病研究等提供新思路和方法。

多维度信息的提取与分析
RADIANT技术不仅成像出色，还能多维度分析成像数据。在图像分割上，依据生物分子标记信息可识别不同细胞类型和组织结构；空间相关分析发现星形胶质细胞中波形纤维蛋白和神经胶质纤维酸性蛋白在小脑白质强相关，暗示其协同作用；细胞类型组成分析通过两种蛋白表达分割出不同分化程度星形胶质细胞，发现其与血管距离分布不同，与星形胶质细胞功能相符；三维距离分析揭示不同分化程度细胞与血管距离差异，反映其功能和发育阶段特点；网络分析计算蛋白中心性，发现β-Ⅲ微管蛋白在小脑浦肯野层中心性高，暗示其对浦肯野细胞的重要性。

总结与展望
RADIANT技术意义非凡。技术上，突破传统成像局限，实现厚组织多目标超分辨率成像，提高成像深度，为观察生物分子三维分布及相互作用提供有力工具。生物学研究中，有助于揭示生物发育分子机制，如小脑发育研究。医学领域，可辅助疾病诊断与病理研究，为肿瘤诊疗等提供关键信息。不过该技术也存在局限。成像深度和染色均匀性依赖样本，成像速度慢，通量受二抗和探针限制。未来可利用促进运输技术提升成像深度和染色效果，借助原位信号放大技术提高成像速度，引入新探针并验证一抗文库增加成像通量，还可拓展至RNA和DNA成像。随着技术完善，RADIANT有望在构建组织图谱、肿瘤研究和脑电路分析等领域发挥更大作用。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。
Shi L, Wei M, Miao Y, Qian N, Shi L, Singer RA, Benninger RKP, Min W. Highly-multiplexed volumetric mapping with Raman dye imaging and tissue clearing. Nat Biotechnol. 2022 Mar;40(3):364-373. 

DOI:10.1038/s41587-021-01041-z.