在现代生物学研究中，CRISPR/Cas9 技术为构建基因敲除小鼠提供了高效精准的手段。以下是运用该技术构建基因敲除小鼠的详细实验流程：

实验设计

1、目标基因的选择与 sgRNA 设计

• 靶基因分析：首先要确定目标基因，着重挑选其外显子区域，一般优先选取早期外显子，这样能有效提高基因敲除的成功率。
• sgRNA 设计：借助专业的在线工具，像 CRISPR Design、Benchling、CRISPOR 等来精心设计靶向目标序列的 sgRNA。设计时要严格把关，筛选出高特异性的 sgRNA，尽可能避免脱靶现象，其长度通常固定为 20bp。与此同时，Cas9 的选择也不容忽视，一般常用来源于化脓链球菌的 SpCas9，并且要保证它与所选的 sgRNA 能够完美兼容。另外，如果实验需要引入特定突变或者大片段缺失，那就得着手设计同源重组修复模板（HDR 模板）。

2、实验动物选择

• 小鼠品系：实验常选用 C57BL/6 或者 FVB/N 等品系的受精卵，而且要选取处于原核期的胚胎。这些品系的小鼠在遗传学研究领域应用广泛，能为实验提供稳定可靠的基础。
• 动物伦理：整个实验必须通过伦理委员会的严格审批，确保实验过程遵循动物福利原则，不对实验动物造成不必要的伤害。

实验材料制备

1、体外转录或合成 CRISPR 组件

• sgRNA 合成：可以通过化学合成的方式，也可以采用体外转录法。若选择体外转录，务必添加 T7 启动子以及 sgRNA 骨架，以此保障 sgRNA 的正常合成与后续功能发挥。
• Cas9 mRNA 制备：同样采用体外转录的方法来制备 Cas9 mRNA，过程中要添加 5' 帽结构以及 polyA 尾，这对提高 Cas9 mRNA 的稳定性至关重要，能确保它在后续实验环节中稳定发挥作用。
• 纯化：完成 sgRNA 和 Cas9 mRNA 的制备后，要对它们进行精细纯化，去除可能存在的杂质。因为杂质一旦混入，极有可能影响后续胚胎的存活率，干扰实验进程。

2、显微注射混合液配制

将 sgRNA 按照 50 - 100ng/μL 的浓度、Cas9 mRNA 以 100 - 200ng/μL 的浓度，一同混合于显微注射缓冲液中，常用的是 RNase - free TE 缓冲液。倘若实验用到了 HDR 模板，还需依据具体实验需求，准确加入线性化质粒或 ssDNA，并合理调整其浓度。

受精卵的获取与显微注射

1、超排卵与受精卵采集

• 超排卵：对雌性小鼠注射孕马血清促性腺激素（PMSG），间隔 48 小时后，再注射人绒毛膜促性腺激素（hCG），以此刺激雌鼠超排卵，为后续获取充足的受精卵创造条件。
• 交配：将完成超排卵处理的雌鼠与雄鼠合笼，之后仔细检查雌鼠阴栓情况，以此确认受精卵是否处于原核期，正常情况下受精后约 0.5 天受精卵会处于该关键时期。
• 受精卵收集：确认受精卵状态后，处死雌鼠，小心冲洗其输卵管，从中精准收集处于原核期的受精卵，这些受精卵将作为后续实验的核心材料。

2、显微注射

• 显微操作：运用专业的显微注射仪，将预先配制好的 CRISPR 混合液（包含 sgRNA、Cas9 mRNA，如有需要还包括 HDR 模板）精准注入受精卵的原核或者细胞质内。这一步操作对技术要求极高，需要操作人员具备精湛的显微操作技能。
• 胚胎培养：完成显微注射后的胚胎，要在适宜的体外环境中培养，直至发育到两细胞期或者囊胚期，这个过程大约需要 24 小时。在此期间，要严格把控培养条件，确保胚胎能够正常生长发育。

胚胎移植与代孕母鼠

1、代孕母鼠准备

通过让结扎雄鼠与雌鼠交配，诱导雌鼠产生假孕状态，这些代孕母鼠将作为胚胎移植的受体，为后续植入胚胎提供孕育环境。

2、胚胎移植

依据胚胎发育所处的阶段，将培养好的胚胎准确移植到代孕母鼠相应的部位，若是两细胞期胚胎，一般移植到输卵管；若已发育至囊胚期，则移植到子宫。为提高妊娠成功率，通常每只母鼠会移植 10 - 15 枚胚胎。

子代小鼠鉴定

1、F0 代小鼠基因型分析

样本采集：待子代小鼠出生大约 3 周后，小心剪取其尾巴，以此提取基因组 DNA，作为后续基因型分析的样本。

PCR 扩增靶区域：专门设计能够扩增 sgRNA 靶点附近区域的引物，利用 PCR 技术对样本 DNA 进行扩增，获取足量的靶区域 DNA 片段用于后续检测。

检测方法：

• TA 克隆测序：将 PCR 产物进行克隆处理，之后测序分析，通过这种方式能够精准检测出插入 / 缺失（Indel）突变情况，为判断基因敲除效果提供直接依据。
• T7E1 或 Surveyor 酶切：这种方法主要用于快速筛查，通过检测双链 DNA 错配情况，初步判断基因是否发生突变，能在短时间内处理大量样本，提高筛选效率。
• 高通量测序（NGS）：该技术能够精确解析突变类型，同时还能深入分析是否存在脱靶效应，为实验结果的准确性和可靠性保驾护航。

2、嵌合体筛选

F0 代小鼠有很大概率是嵌合体，即其身体部分细胞携带突变基因。为获得稳定遗传的纯合子，需要将 F0 代小鼠与野生型小鼠进行配种，繁育出 F1 代，再从 F1 代中筛选出纯合子个体。

表型分析与品系建立

1、表型分析

生理功能检测：密切观察子代小鼠在生长发育过程中的各项生理指标，包括生长速度、行为模式、代谢水平等方面是否出现异常，以此推断基因敲除对小鼠整体生理功能的影响。

分子水平验证：运用 Western blot、qPCR 等分子生物学技术，检测目标蛋白或者 mRNA 在小鼠体内的表达情况，确定是否因基因敲除而出现表达缺失，从分子层面揭示基因功能变化。

组织学分析：制作小鼠组织病理切片，在显微镜下细致观察不同组织器官的结构和细胞形态变化，探寻是否存在组织特异性的表型改变，进一步剖析基因敲除引发的深层次生物学效应。

2、品系纯化

通过连续回交或者兄妹交配的方式，在 F1 代、F2 代中逐步筛选并培育出纯合子个体，建立起稳定遗传的基因敲除小鼠品系，为后续深入研究提供可靠的动物模型。

注意事项

脱靶效应：在实验前期，要充分利用生物信息学工具预测可能出现的脱靶位点，对于关键实验，如有必要还需进行全基因组测序验证，确保实验结果的精准性，避免因脱靶效应导致错误结论。

胚胎存活率：由于显微注射操作具有一定的侵入性，很可能对胚胎造成损伤，进而影响其存活率。所以在实验过程中，要反复优化注射条件，包括注射物质的浓度、注射体积等参数，尽可能降低对胚胎的伤害，保障实验顺利推进。

基因型 - 表型关联：鉴于 F0 代嵌合体小鼠表型可能不明显，不能仅凭 F0 代表型判断基因功能，需要通过繁育获得 F1 代，对 F1 代进行全面系统的表型分析，以此建立准确的基因型 - 表型关联，揭示基因的真实功能。